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北京快3聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤

发布时间 2020-11-02 02:08

  聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤_生物学_自然科学_专业资料。聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤 一、制胶前的准备 1、玻璃板的准备 用洗涤剂将玻璃板反复擦洗,然后用清水冲洗干净,待玻璃板晾干后,将 1mm 塑料薄片沾少许 清水,使其贴在玻璃板上,然后将另一块凹行玻璃板

  聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤 一、制胶前的准备 1、玻璃板的准备 用洗涤剂将玻璃板反复擦洗,然后用清水冲洗干净,待玻璃板晾干后,将 1mm 塑料薄片沾少许 清水,使其贴在玻璃板上,然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴。 2、垂直平板支架的安装 将准备好的玻璃板,放入垂直支架内,两侧用钢夹使其固定,钢夹的高度不要超过凹行玻璃的 凹口处为宜,两侧选用力度大小适中、对称的钢夹。 3、玻璃板的密封 将 1%琼脂糖用微波炉加热融化后,倒入支架板底槽中,使其密封即可,然后用吸管吸取少量琼 脂溶液,沿玻璃板两边的缝隙内加入,使其密封,待其冷却凝固后备用。 二、凝胶的制备 1、30%的丙烯酰胺溶液的配制(1L) 配方:丙烯酰胺(Acr)290g 甲叉双丙烯酰胺(Bis)10g 步骤:称取样品,倒入烧杯中 用蒸馏水定容至 1 L 将烧杯置于搅拌器上,使溶液充分溶解至透明 将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用 2、10xTBE 溶液的配制(1L) 配方:Tris:108g;硼酸:55g ;EDTANa2:7.44g 步骤:称取各成分至烧杯 用蒸馏水定容至 1L 用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解 分瓶倒装待用 3、PAGE 凝胶的制备(一块胶为例) 配方:30%的丙烯酰胺溶液 10ml ; 10xTBE 溶液 4ml;双蒸水 16ml;20%的过硫酸铵(AP) 200ul;TEMED 溶液 20ul 步骤:将各成分称量好之后混合好以备灌胶 4、灌胶 把垂直支架倾斜 30° ,将配好的 PAGE 凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口 7mm 处 为宜,倒入过程中要避免气泡的产生,发现有气泡产生时,要待气泡消失后再倒入。灌胶完成后, 用枪吸取少量水密封胶口,压平胶面。当胶面与水之间有一条明显的界限时,北京快3,表示凝胶已凝固,可 以开始点样电泳。 三、点样及电泳 1、0.5xTBE 缓冲溶液的配制 量取 950ml 的蒸馏水,然后加 50ml 的 10xTBE 溶液至 1000ml 处,装瓶摇匀,备用。 2、垂直平板电泳槽的安装 将制作好的胶放入垂直电泳槽内,凹形玻璃向内侧。选择合适的梳子,轻轻插入玻璃板内,梳 子底部与胶面刚好接触为宜。将插好梳子的玻璃板紧贴电泳槽的硅胶密封圈,用钢夹使其固定。 倒入 0.5xTBE 缓冲溶液于电泳槽内,以刚好淹没凹形玻璃平口为宜。 3、点样 用微量移液器吸取 1ul 的溴酚蓝溶液,根据 PCR 产物量大小吸取适量样品,点入胶孔内即可。 每次加样前,微量移液器要用蒸馏水清洗,以避免交叉污染。为了确保各个胶孔之间都相互隔离, 在点样之前可先吸取少量的溴酚蓝点入胶孔两端,看是否有渗漏现象,如果有渗漏现象,要重新安 装梳子。每块胶都要点上 maker 标记。 4、电泳 点样结束后,接通电源,调节电压至 300V,90min,时间电泳时间根据 PCR 产物分子量适当延 长。 四、染色、显影 1、染色液、显色液的配制 染色液:0.1%AgNO3。AgNO3 1g 加水至 1L 溶解待用。 显色液:2%NaOH。NaOH 20g 加水至 1L 溶解待用 2、取胶 把电泳完成后的玻璃板取下,小心拔出梳子 揭去凹形玻璃,去掉底部的琼脂凝胶,小心将胶揭下,放入染色槽中 3、染色 将胶用蒸馏水冲洗 2 次,倒入适量的染色液,以淹没胶体为宜,计时 10min 4、显影 染色好的胶体,用蒸馏水冲洗 2 次,倒入显色液(用前加 3ml 的甲醛) ,轻摇至显出清晰的带为 止 5、拍照 将显好色的胶用水冲洗 2 次后,置于玻璃板上,在室温下拍照,用于分析处理。

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