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DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

发布时间 2020-11-02 02:09

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  的稳定性考察 考察— Aptamer 的稳定性考察—聚丙烯酰胺凝胶电泳 Aptamer 识别肿瘤细胞 若选择 4℃识别,则需要提前控温离心机,且样品在上样检测前宜放置于冰中;37℃就不用控温了。 Aptamer 浓度:荧光标记的是 50μM,没有标记的是 100μM 提取----DNA 提取-----注意实验中戴好橡胶手套,穿好实验服,以防苯酚粘到皮肤上。 1. 取 7.3μl aptamer(100μM)于 1460μl 小鼠血清(无需过滤)中,在 37℃细胞培养箱中孵育; 2. 于不同时间点(6h, 5h, 4h, 3h, 2h, 1h, 1min)取 200μl 该小鼠血清到新的 EP 管中,加入 200μl(等体 积)的苯酚-氯仿(取苯酚-氯仿之前先将苯酚-氯仿混匀) ,混匀,管中溶液变浑浊; 3. 用 15000 转/分离心 10 分钟,管中出现 3 层:上清、白色变性蛋白层、北京快3苯酚层; 4. 取上清到新的 EP 管中。在原 EP 管(变性蛋白层和苯酚层)中加入 200μlTE 溶液,混匀(该步进一步提取残 留的 DNA) ; 5. 用 15000 转/分离心 10 分钟,收集上清; 6. 重复 4、5 步直到上清澄清; 7. 在上清中加入等体积的氯仿(用于去除苯酚) ,混匀,用 15000 转/分离心 10 分钟,取上清到新的 EP 管中; 8. 加入等体积(用于去除氯仿) ,混匀后静置 10 分钟,弃上层(比水轻,在上层) ; 9. 重复步骤 8,敞开管盖 15 分钟,待挥发; 10. 加入 1/10 体积的 3M NaAc、2 倍体积的无水乙醇,放置于-20℃冰箱中 30 分钟(DNA 沉淀) ; 11. 用 16500 转/分(转速不宜再高,EP 管容易破裂! )离心 30 分钟; 12. 将管中溶液吸出,转移至新的 EP 管中。原管中保留约 30μl 溶液,打开管盖,待管中溶液蒸发; (我通常将 EP 管敞开,封上封口膜,再扎 7、8 个孔,放在通风橱中过夜。(管底看不到沉淀,因为 DNA 含量太低。 ) ) 13. 在管中加入 16μL 1*TE 溶液; 14. 进行电泳分析前,将样品在 95℃水浴中加热 10 分钟(小心管盖冲开或进水) ,在冰上骤冷(使 DNA 成单链) , 上样或保存在-20℃冰箱中。 ! 聚丙烯酰胺凝胶电泳------注意实验中戴好手套!! ;有凹槽的一面向内! !压紧,避 1. 准备:清洗干净玻璃板、凉干!装好电泳的玻璃板(用 1.5mm 的厚玻璃板) 免漏液! 2. 配胶: 20%变性聚丙烯酰胺凝胶 8ml:称取尿素 3.36g,加入 45%丙烯酰胺溶液 3.56ml,5×TBE 1.6ml,加热 使尿素溶解(可用 55℃水浴加热) ,通过 10ml 量筒加水至 8ml,轻混匀后放在冰上冷却(溶液温度较高时,加入 催化剂后将迅速凝胶,甚至来不及灌胶) ,加入 3-6μlTEMED(助催化剂) 、10%过硫酸铵 60μl(催化剂) 。催化 剂过多可能导致来不及灌胶就凝胶! ! 3. 灌胶:加入 TEMED 和过硫酸铵后,用 tip 头轻搅混匀,迅速灌胶;灌胶应当一次性、顺畅地完成,避免形成 断层!插上梳子,约 30 分钟成胶(观察梳孔间的凝胶情况) ; 4. 垂直小心地拔出梳子,小心产生气泡;拿掉玻璃板底下的防漏胶带!重新装好玻璃板!注意有凹槽的一面向 内! ! 5. 用超纯水、1×TBE 溶液冲洗加样孔(很重要,若没有清洗干净,将影响电泳) ;加满整个梳孔后用滤纸吸干 即可。 6.将电泳槽及电泳装置灌满 1*TBE 缓冲液(盖过凝胶) ; 7. 上样:取 8μl 样品和 2μl loading buffer 混匀,用 10μl 微量注射器加样(方便伸入加样孔) ; 8. 电泳:先用 40V 电压电泳 1 小时,再用 80V 电泳约 3-4 小时,至溴酚兰带(loading buffer 中一般含有 2 种 指示剂,跑的较慢的青兰色是二甲苯氰,跑的较快的蓝色是溴酚兰)跑至胶的 1/2-2/3,停止电泳; (在不同浓 度的胶中,溴酚兰电泳的速度可与某长度的核酸相当,参见我电泳的资料或者李伟师姐的实验书) ;电泳过程中 会产热而影响电泳效果,可以将电泳装置置于冰盒中,注意保持水平! ! 9. 染色:小心取出凝胶,放在合适的培养皿中,用 1×SYBR Gold(至少 30ml)避光、在摇床中染色 20 分钟(室 温还是??) (第 2 次染色 30min,第 3 次 40min,建议 SYBR Gold 最多重复利用 3 次。 ) 10. 成像:用凝胶成像系统成像。开机密码:123456。 [溶液的配制] 溶液的配制] Binding buffer 在 D-PBS 中加入:葡萄糖+MgCl2+BSA(在 307 超高速离心机旁冰箱的柜门中间栏);混匀后取部分加入 10%胎牛血 清; 剩下溶液中加入 10%NaN3(在 307 超高速离心机旁冰箱的 4℃最上层的左边最里面),混匀,为 Washing buffer。 苯酚苯酚-氯仿 Tris 饱和苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 配制方法:将 Tris-Hcl 平衡酚与等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合均匀后,移入棕色瓶 4℃保存。 45%丙烯酰胺溶液 45%丙烯酰胺溶液 丙烯酰 丙烯酰胺: 43.4g 加水定容 100ml,用一次性滤头过滤,保存于棕色瓶中。 (可加热至 37℃促进溶解) N, N-亚甲基双丙烯酰胺: 1.6g (丙烯酰胺单体具有很强的神经毒性,可通过皮肤吸收且具有累积效应,配制过程中应严格戴手套实验服;聚丙 烯酰胺无毒,但也应谨慎操作。) EDTA, 0.5M EDTA,50ml )调 称取 Na2EDTA.2H2O(372.24g/mol)9.306g,加水 40ml 后边搅伴边加 NaOH(浓 NaOH 或者固体 NaOH 1g 左右! pH 值至 8.0(EDTA 将逐渐溶解,若 pH 值到 8.0 后仍有少量不溶,可适当加热) ,定容至 50ml。高温高压灭菌, 室温保存。 5×TBE Tris: 硼酸: 27g 13.75g 加水至 500ml。 (用橡胶塞做瓶盖) 0.5M 的 ETDA(pH8.0) :10ml (5*TBE 是配胶时用的,电泳时所用的缓冲液是 1*TBE 浓度! ) Tris-HCl, 8.0, 0.05M 的 Tris-HCl,pH 8.0,100ml 称取 Tris 0.6057g,加水至 80ml 后,用浓 HCl 调 pH 值至 8.0,定容至 100ml。 高温高压灭菌,室温保存。 1*TE 溶液, 8.0, 1*TE 溶液,pH 8.0,100ml 0.05M Tris:20ml 0.5M ETDA:200μl 加水至 100ml。高温高压灭菌,室温保存。 3M NaAc, pH5.2, 50ml 称取 NaAc·3H2O(136.08g/mol)20.412g,用冰醋酸调 pH 值至 5.2,定容至 50ml,高温高压灭菌后使用,室温 保存。 Gold---------染色前配制 SYBR Gold----取 10000×SYBR Gold (n) μl,加入到(10n)ml 1×TBE 溶液中,装在棕色瓶中避光保存;建议最多重复利用 3 次,且配置后不宜放置 1 周以上,以免染色效果不好。 10%过硫酸铵( 去离子水中) 10%过硫酸铵(1g 溶解于 100ml 去离子水中) 过硫酸铵 现配 1ml 左右,保存于-20℃冰箱中,保存时间不宜超过 2 个月;保存于 4℃冰箱中,保存时间不宜超过 3 周; 保存在常温下,只能放置几天。

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