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发布时间 2020-11-17 23:40

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  蛋白质分离纯化及鉴定 ? 凝胶过滤层析法 ? 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶过滤层析法 1. 试验原理 利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用,根 据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 凝胶层析的原理 Kd=(Ve-Vo)/Vi 优点 a. 条件温和 b. 操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 2. 凝胶及凝胶柱的选择 根据不同分子量选择不同凝胶 a. Sephadex: 交联葡聚糖 G-10,15,25,50, 75,100,150,200;得水值 X 10 b. Sepharose:琼脂糖凝胶 Bio-Gel A c. Bio-Gel P:聚丙烯酰胺凝胶分子筛 d. Sephacryl:用N,N-亚甲双丙烯酰胺交联 的葡聚糖凝胶 凝胶柱的选择 3. 凝胶的前处理 a. 溶胀:称取适量凝胶干粉,用约10倍蒸馏水 浸泡24小时以上,待凝胶充分溶胀后,倾去 上层悬浮物及蒸馏水。 b. 碱洗:用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时,然 后用蒸馏水洗至中性。 c. 酸洗:用0.5 M HCl 溶液浸泡半个小时,然后 用蒸馏水洗至中性。 d. 平衡:用起始缓冲液浸泡凝胶,直至凝胶液 pH与起始缓冲液相同。 4. 装柱 a. 将层析柱垂直固定,加入适 量溶剂排走空气。 b. 将平衡好的凝胶搅匀,连续 倾入柱中,待其自然沉降至 1/4~1/3高时打开下端出口, 让溶剂慢慢流出,继续侵入 凝胶至沉降到所需高度。装 柱时要注意操作压。 c. 用3-5倍柱床体积的起始缓冲 液走柱,使交换剂充分平衡, 柱床稳定。 5. 样品上柱、洗脱、 收集。 a. 如图装好层析装置,打开下端出 口,使溶液流出至刚好达到凝胶 胶面 b. 沿柱壁缓慢加入2ml样品,打开下 端出口,使样品溶液流出至刚好 达到凝胶胶面,再取少量起始缓 冲液洗涤柱壁。 c. 打开起始缓冲液阀门,连续洗脱。 d. 用自动部分收集器自动或手动收 集,合并同一高峰各管。 6. 凝胶的再生及保存 再生 用过的凝胶经0.5M的NaOH和HCl溶 液分别处理后可以恢复其性能 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠 或0.002%双氯苯双胍己烷 应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1.原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称 Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在 加 速 剂 N , N , N , N- 四 甲 基 乙 二 胺 ( 简 称 TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素 (VB2)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝 胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺 凝胶电泳(简称PAGE)。 1.1 聚丙烯酰胺凝胶优点 1) 化学性能稳定,对pH和温度变化不敏感; 2) 重复性好; 3) 灵敏度高,可达10-6 g; 4) 分辨率高。 1.2凝凝胶胶浓浓度度的的选选择择与与被被分分离离物物质质分分子子量量密密切切相相关关 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 104 1-4×104 1-5×104-1×105 1×105 5×105 适用的凝胶浓度/(%) 20-30 15-20 10-15 5-10 2-5 1.3 种类 1) 连续系统与不目前常用的多为圆盘电泳(图1)和 板状电泳(图2),两者电泳原理完全相同。 2) 聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统两大类。 图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面) (1)样品胶 pH 6.7 (3)分离胶 pH 8.9 (2)浓缩胶 pH 6.7 (4)电极缓冲液 pH 8.3 图2 夹心垂直板电泳槽示意图 1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线.上贮槽 7.冷凝系统 蛋白质微型电泳系统 图3 蛋白质微型电泳系统 1.4 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成 1) 浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液 为pH 6.7的Tris-HC1。 2) 分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液 为pH 8.9 Tris-HC1。 3) 电极缓冲液是pH 8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径 的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成 了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性, 这是样品浓缩的主要因素。 1.5 不连续体系凝胶对蛋白的分离作用 1) 样品浓缩效应 A. 凝胶孔径不连续性 B. 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 C. 电位梯度的不连续性 2) 分子筛效应 3) 电荷效应 2. 操作步聚 2.1 SDS-不连续体系凝操胶作制步备聚 聚丙烯酰胺凝胶配制 试剂名称 分离胶 (8%) 浓缩胶 (4%) 分离胶缓冲液 1.25 ml / 浓缩胶缓冲液 / 0.5 ml 水 2.4 ml 1.2 ml TEMED 10 ul 5 ml AP 60 ul 25 ul 2.2 样品处理 适量浓度蛋白溶液加入1×上样缓冲液 混匀,95℃水浴中处理5分钟。 2.3 加样 用微量进样器取10-15 l上述混合液,通过电 极缓冲液,小心地将样品加到凝胶凹形样品槽底部。 2.4 电泳 将电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽连 接,打开电泳仪开关,开始时电流为10 mA,待样品进 入分离胶后,将电流调至20-30 mA,当溴酚蓝染料距 硅胶框1 cm时,停止电泳,关闭电源。 2.5 染色与脱色 电泳结束后,取下凝胶模,卸下 胶框,用凝胶铲小心撬开短玻璃板,从凝胶板上切 下一角作为加样标记,在两侧溴酚蓝染料区带中心, 加入染色液染色1-2 h,再用脱色液脱色,直至蛋 白质区带清晰,即可计算相对迁移率 2.6 结果处理 各蛋白质样品区带中心与加样端的距 离(cm),按下式计算相对迁移率mR: 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 相对迁移率mR= 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm)

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