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常规聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

发布时间 2020-12-04 21:26

  常规聚丙烯酰胺凝胶电泳(conventionalpolyacryamidegelelectrophoresis)简称NativePAGE。它是根据蛋白质分子在缓冲液中的大小,形状以及带电(负电或正电)的多少,在恒定pH(碱性或酸性)缓冲系统中的分离,主要用于检测样品纯度和测定蛋白分子质量。本实验来源「蛋白质电泳实验技术」主编:郭尧君。

  用于垂直平板电泳的凝胶通常被灌注在两侧有隔片的两块玻璃板之间。模具垂直放置,周围用硅油(或其他密封物质)密封,或用夹子夹紧,以免胶液泄漏。溶液从顶部灌注。灌胶完成后从顶部插入梳子,以形成加样孔。梳子宽度取决于玻璃板的宽度,梳子的厚度和凝胶的厚度取决于隔片的厚度。

  在垂直电泳装置上可以进行连续电泳或不连续电泳。它们的差别之一在于制胶方法的不同。连续电泳仅有分离胶,并且整个电泳使用相同缓冲系统,所以灌胶是极为方便的。不连续电泳需要先灌注分离胶(均一胶或梯度胶),再灌注浓缩胶,需要掌握一定的技术。垂直电泳用的灌胶模具种类繁多,应根据说明书使用。常用的连续电泳的凝胶配方,贮液配置如下:

  11.1 g 丙烯酰胺 + 0.3 g N,N-甲叉双丙烯酰胺,先用 35 ml 双蒸水溶解, 搅拌,直到溶液变成透明,再用双蒸水稀释至 50 ml,过滤。用棕色瓶,可在 4℃ 保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物,要小心操作。

  由 Ornstein 和 Davis 首先发展的不连续电泳(当时用于圆盘电泳)是将浓缩胶(非排阻性大孔凝胶)加在分离胶上,并且使用不同缓冲系统。所以需要分别灌注分离胶和浓缩胶。不连续电泳的凝胶配方,贮液配置如下:

  14.55 g 丙烯酰胺 + 0.45 g N,N-甲叉双丙烯酰胺,先用 35 ml 双蒸水溶解,搅拌,直到溶液变成透明,再用双蒸水稀释至 50 ml,过滤。用棕色瓶可在 4℃ 保存一个月。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体及溶液是中枢神经毒物,要小心操作。

  按配方在模具中灌注分离胶后, 小心地在分离胶的表面加一层水(或水饱和的异丙醇或正丁醇),封住胶面,以促使聚合并使凝胶表面平直。 凝胶在 30~40℃ 放置约 40 分钟~1 小时后,可以看到一个界面,表示凝胶聚合。吸掉水(或水饱和的异丙醇或正丁醇),用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶,然后灌注浓缩胶。并插入与模具大小相同,与凝胶厚度相当的梳子。为防止气泡陷入,梳子应倾斜插入。然后让模具再静止放置在 30~40℃,聚合约 40 分钟~1 小时。如果带着梳子过夜可能会影响分辨率,所以浓缩胶最好在使用前再灌注。

  如灌注线性梯度胶,则在灌注分离胶时需要用梯度混合器,有时还需要蠕动泵。梯度混合器分贮液腔(盛轻液)和混合腔(盛重液)。两腔间有腔间阀。后者与出口相连接。混合液从混合腔中流出。改变两个腔的大小或溶液配方,就能改变梯度的斜率。在贮液腔中插入凸形锥体(convex ) 或凹形锥体(convave) 就能形成指数梯度(指数梯度不常用)。梯度混合器的使用方法参见“水平平板电泳的制胶”。

  水平电泳与垂直电泳的制胶方法在连续电泳时相同,不连续电泳时的制胶方式都为垂直灌注,差别只在于:

  1. 垂直电泳用的凝胶在顶端用梳子形成加样孔,而水平电泳可在凝胶聚合后在胶面上加样或在凝胶上做加样孔。

  2. 垂直电泳必须先灌注分离胶,后灌注浓缩胶,以便插入梳子;水平电泳用的凝胶是平铺在冷却板上电泳的,所以可以先灌注浓缩胶,后灌注分离胶。且浓缩胶中加有甘油,所以不需等待聚合,便可接着灌注分离胶,使操作大为简便。而且由于浓缩胶中的甘油使加样孔中保有一定的水,所以对样品的高盐浓度不敏感,有时可以免去透析。

  3. 垂直电泳是先灌注分离胶,所以底部的梯度胶浓度最大;而水平电泳是后灌注分离胶,所以顶部的凝胶浓度最大。这样在聚合时不会有热对流的干扰。 并且这种灌注法不会在小孔径凝胶中有高浓度的甘油,可以避免在电泳时由于甘油吸湿而引起小孔的泡胀。

  4. 垂直电泳制胶后,不需取胶,仍将胶置于玻璃板中电泳;但水平电泳需要将聚合后的凝胶从灌胶模具中取出,平铺于冷却板上进行电泳,因此电泳时冷却效果较好。

  5. 目前水平电泳用的凝胶厚度大多薄于垂直电泳。薄胶从分辨率,电泳时间, 灵敏度,保存方便,实验材料的节省等方面都显然优于厚胶,是当前发展的方向。

  如果要在凝胶上做加样孔,需要准备一块可重复使用的小孔成型模板。模板通常是用不附着胶的玻璃板制作的。先用去污剂清洗玻璃板,然后用蒸馏水淋洗。用滤纸吸干,再用无水乙醇淋洗玻璃表面以去掉任何残留的不纯物。把玻璃板放在坐标纸上,贴几层隔片带在玻璃表面上,见图 4.9。用一把锐利的刀去掉多余的隔片带。在小孔成型条之间切成 2~3 mm 的小段。所加层的数目和条的宽度取决于样品体积。小孔成型条的长条取决于计划的加样数。例如,加 5 ml 样品,小孔成型条应该是两层厚,2 mm 宽和 7 mm 长。小孔成型条制成的孔可加多至 100 μl 的样品。

  隔片带可以用 DYMO 带(一种不干胶带)制作小孔成型条。如果凝胶厚为 1 mm,应在玻璃模板上贴两层。如果凝胶厚为 0.5 mm,应贴一层。为了保持电流通过小孔,凝胶层应覆盖在小孔底部最小厚度 0.2 mm。

  小孔应做在浓缩胶和分离胶界面的浓缩胶一侧,使小孔和阴极之间为均一的浓缩胶。见图 4.9 和图 4.10。

  组装模具前先将玻璃板洗净,在不黏胶的玻璃板上涂一层不黏胶的硅烷。把黏胶的支持膜铺在另一块玻璃板上,用滚筒赶去气泡和多余的水,用夹子夹好模具(见图 4.11)。为防止凝胶在灌注时聚合,应预先将模具放在 4℃ 冰箱中预冷。灌注线性梯度胶的贮液同不连续电泳,配方见表 4.7。先将一定量的轻液注入梯度混合器的贮液腔,小心打开腔间阀,赶去腔间气泡,如有轻液流入混合 腔,需吸回贮液腔,关上腔间阀。再将重液注入混合腔,并加入搅拌子。梯度混合器应置于已调水平的磁力搅拌器的合适位置上,两腔中的液面应该相平。每腔先各加入 TEMED,再加过硫酸铵。先打开腔间阀,再立即打开流出管的夹子, 两腔中的液面应同时下降。梯度混合器与模具之间应有合适的高度差,使灌注在 1~5 分钟完成。灌注后在室温静止 15 分种,再放在 30~40℃ 烘箱中聚合。聚合约需 1 小时完成。聚合后在 4℃ 至少放置 12 小时使其充分聚合,孔径均匀后才可使用。梯度胶的灌注比较繁杂,但它可以分离复杂样品。由于分子筛的作用,有较好的分辨率,且谱带细窄。

  常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的样品不需作特殊处理。最重要的是选择合适的 pH 和离子强度的缓冲液作为样品缓冲液,以保证样品的溶解性、稳定性和生物活性,通常使用与缓冲系统相同的 pH, 但离子强度只为其十分之一。如样品需要特殊的稳定剂,保护剂等,应视其是否影响电泳。

  为了观察电泳前沿,在样品缓冲液中应加有色指示剂,阳极电泳通常用溴酚蓝,阴极电泳通常用焦宁(pyronine)。

  如是粉末样品,用样品缓冲液溶解成合适浓度。如果是带有高盐浓度的溶液样品,应先用透析方法或用 Sephadex G-25 的凝胶过滤柱脱盐,再用低离子强度的样品缓冲液平衡,使终离子强度符合样品缓冲液的要求。

  如样品溶解不佳,可用尿素或非离子去污剂如 TritonX-100,NP-40 来助溶。配制好的样品最好在 10000 万转左右的台式离心机上离心 3~5 分钟,取上清加样,以免电泳时产生拖尾。

  如果需要测定分子质量,则必须准备蛋白标准样品。现在市售的蛋白标准大多是由一系列纯化的,不同分子质量的蛋白质组成,它们之间不会发生相互作用,且有良好的线性关系。如安玛西亚公司的蛋白标准,分子质量范围为 66 000~669 000 Da,由 5 种蛋白组成。

  蛋白标准也可自己配制,选择 5~7 种合适分子质量范围的蛋白溶解在样品缓冲液中,分装后,在 -20℃ 保存。注意不要错用 SDS 蛋白标准。

  样品的浓度取决于样品的组成,分析目的和检测方法。对未知样品可作一个 0.1~20 mg/ml 蛋白的稀释系列,以寻找最佳加样浓度。如用考马斯亮蓝染色,可用浓度为 1~2 mg/ml 的样品。如果样品组分复杂,如细胞匀浆液,为了观察痕量成分,主带便会过量。对高纯度样品,0.5~2 mg/ml 蛋白为最佳。银染色所用的样品浓度可比考马斯亮蓝染色低 20~100 倍。用同工酶染色,免疫固定染色视方法不同而异。电泳后欲进行转移,应有足够的样品量。

  如进行垂直电泳,加样前轻轻将梳子倾斜拔出,防止气泡陷入。用电极缓冲液淋洗加样孔,吸出,再加适量电极缓冲液。然后用微量注射器小心将样品加成一细窄带(特别是连续电泳),否则将影响电泳分辨率。如果没有足够数目的样品,应在加样孔中加样品缓冲液,不要留有空孔,以防止电泳时邻近带的扩展。

  如进行水平电泳,可以在胶面上直接加样,或用滤纸块加样,或在加样孔中加样。在凝胶面上直接加样时不可超过 3 μl。加样间距大于 1 cm 才可加 5 μl。对连续电泳,一定要加成一条细窄带,否则会影响分辨率。对不连续电泳,由于浓缩胶的作用,在进入分离胶以前会浓缩成细窄带。阳极电泳的样品加在阴极侧,阴极电泳的样品加在阳极侧。

  如果进行垂直电泳,按说明书先在电泳槽的下槽中装入电极缓冲液。将聚合后的凝胶连同玻璃板一起放入电泳槽中,在上槽中注入电极缓冲液,打开冷却循环系统,连接电源。一般起始电压约为 70~80V,然后不断升高。起始电流可设置为 20~30 mA,取决于凝胶的厚度,大小和样品数。在电泳过程中,应记录电参数的变化,以便以后重复。一般垂直电泳需要 2~6 小时,取决于凝胶孔径,特别是缓冲系统和电参数的选择。

  待溴酚蓝前沿到达电泳槽底部(阳极)时,切断电源,关掉冷却循环系统。取出凝胶,准备染色。

  目前有三种方式进行水平电泳。一是搭接滤纸桥,这是最经典的方式。二是使用半干技术,即用凝胶条或滤纸块的方法。经典方法的操作比较麻烦,电泳时间一般需要 2~4 小时。使用半干技术,操作简便,电泳时间只需 0.5~1 小时左右,并且不影响分辨率。

  1. 先将电极缓冲液加在电泳槽两侧的缓冲液槽中,打开冷却循环系统,调节温度在 4~12℃。视室温而定。室温低时,设置较低的温度。反之,室温高时或样品中有尿素时,设置较高的温度。

  2. 在冷却板上铺一层煤油或液体石蜡(冬天因液体石蜡太黏稠,不宜使用),再铺凝胶,并赶出其间的气泡。使凝胶和冷却板有很好的接触,以排除电泳过程中在凝胶上产生的热。

  3. 用电极缓冲液浸泡 8~10 层滤纸电极芯,并确保滤纸之间没有气泡。将泡好的电极芯与凝胶搭接,至少重叠 1 cm。为了在凝胶上两电极之间得到均匀的电压梯度,使电泳区带平直,两侧电极芯与凝胶搭接的边缘必须严格平行。电极芯的另一端悬在电极缓冲液中。

  4. 打开电源,开始预电泳,以去除凝胶中的不纯物质。预电泳时间一般为 20 分钟,时间过长会产生电解产物。

  5. 加样可直接滴加在凝胶表面(不多于 3 μl ),或滴加在加样孔中,或加在合适孔径的滤纸块上。加样后,进行 5~10 分钟的低电压,低电流电泳(原电压和电流的 1/5 到 1/2 ),以使蛋白质分子顺利地进入凝胶。

  6. 电泳时按说明书选择合适的电压,电流和功率参数,阳极电泳时,待溴酚蓝前沿接近阳极(阴极电泳时,待指示剂前沿接近阴极)后,关掉电源,停止电泳,准备染色。

  用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。选用染料通常应考虑以下要求:

  1. 必须与大分子结合以形成一个不溶性的,有色的,紧密的复合物,但不结合到凝胶中和支持膜上,以便从凝胶中除去,否则高背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描。

  4. 选用能与大分子有专一性结合的染料,并在结合后能产生不同的颜色(如荧光),可以提高检测的选择性和灵敏度。

  用 7% 醋酸或 5:5:1 体积比的水:甲醇: 冰醋酸的混合溶剂配制 1% 氨基黑溶液,过滤后备用。将凝胶在染液中浸泡 2~6 小时,然后用上述溶液脱去背景。

  如欲加速染色,可以加温。由于水、甲醇、醋酸混合溶剂的轻度水化作用,凝胶有时会收缩,所以需要根据凝胶的浓度,大小和形状来控制染色和脱色的时间。

  2. 不同的蛋白结合不同量的染料,可以呈现不同的颜色,如蓝黑色或棕色,所以每个组分需要自己的标准曲线. 染色的不均一性和高背景使得用氨基黑染色得到的扫描面积不仅决定于蛋白量,而且决定于迁移距离以及区带周围的背景。Racusen 根据他的实验数据,1 mol/L 的碱性氨基酸结合 0.56±0.6 mol/L 的氨基黑,建议将电泳后的凝胶浸在 0.01% 氨基黑(在 7% 醋酸中)中至少 16 小时,并加热,搅拌。

  在蛋白染色方法中,目前以考马斯亮蓝染色最为常用。因为它既克服了氨基黑染色灵敏度不高和进行定量扫描的限制,又比下一节将介绍的银染色方法简便。

  考马斯亮蓝染色首先是由 Fazekas 等在 1963 年用于醋酸纤维素膜电泳, 并认为同样可用于纸电泳,琼脂电泳和淀粉凝胶电泳。1965 年 Meyer 等将此方法用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。检测灵敏度约为 0.2~0.5 μg。

  H 基团,偏酸性, 与氨基黑一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。在一定 pH 时,这种染料-蛋白复合物被完全解聚。考马斯亮蓝 R-250 与不同蛋白结合呈现基本相同的颜色,并且在比较宽的范围内 (15~20 μg),扫描峰的面积与蛋白量有线性关系。对一些蛋白,如尿素酶,线 μg。考马斯亮蓝又分为 R-150、R-250、R-350、G-250 等。其中 R-350 最为灵敏,R 为红蓝色,G 为蓝绿色。考马斯亮蓝 G-250 即二甲花青亮蓝(Xylene Cyanine Brilliant Blue G250), 是一种甲基取代的三苯基甲烷。考马斯亮蓝 R-250和 G-250 的结构式如图 4.13。不同的配方,不同的染色方法适合于不同性质的蛋白,有关考马斯亮蓝的染色方法见 Righetti 的综述。

  考马斯亮蓝有两种染色方法:一种是先固定,再进行染色和脱色。第二种是同时进行固定和染色,再脱色。固定液、染色液、脱色液的配法很多,方法也很多。表 4.9 列示三种方法供参考,表中方法一和方法三固定较好,方法二则比较简便快捷,且在系统中不使用甲醇。固定和染色的时间,特别是后者,取决于凝胶的厚度、孔径及有否支持膜。固定的时间可以长一些。染色时间不宜过 长,否则增加脱色的困难。Fishbein 的实验证明,染色时间超过 12 小时,染色强度不会增加。为了加速染色和脱色过程,可加温和搅拌染色液和脱色液。在染色后,脱色前用脱色液浸湿的棉花球轻轻擦洗凝胶表面,除去染料颗粒,可使脱色的凝胶清晰明亮。这是常用的扩散脱色法。如果有条件也可以用电泳脱色法。因为考马斯亮蓝是偏酸性染料,可将染色后的凝胶放在有孔的塑料片之间, 系统中充以 7% 醋酸。水平电极置于两侧,并与一个大电流的电源相连接。这样脱色便可在 15~30 分钟内完成。

  由于常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的系统中没有 SDS,所以染料贮液可以重复使用。如果贮液中出现颗粒,可以过滤除去。只是重复使用的染液不能控制浓度, 不利于定量测定。用过的脱色液可以用活性炭吸附过柱,以节省溶剂。

  对碱性蛋白和低分子质量多肽的检测,Steck 等认为最好使用甲醛固定。 因为甲醛能交联蛋白和聚丙烯酰胺凝胶,使蛋白不会在染色时丢失。

  考马斯亮蓝染色的第二种方法是同时进行固定和染色。考马斯亮蓝 G-250 常用这种方法。这种方法的特点是快而简便,有时甚至不需脱色。灵敏度略逊于 R-250。Blakesley 等报道整个染色过程只用 30 分钟,可检测大于 1 μg 的蛋白。 Vesterberg 介绍了三种 G-250 染色方法,检测灵敏度可优于 0.2 μg, 最快染色过程也只需 1 小时。在这类方法中,常将考马斯亮蓝溶于三氯醋酸或过氯酸中,在这两种溶剂中,考马斯亮蓝是很难溶解的,结果形成的主要是染料和蛋白质的复合物,所以染色很快。在 Reisner 的实验中可以看到染料在稀过氯酸溶液中和结合到蛋白上时呈现的颜色变化,且富含赖氨酸的组蛋白由于可溶解于过氯酸不能被检测,但能选择性地检测到富含精氨酸的组蛋白。表 4.10 列示三种方法供参考使用。

  考马斯亮蓝 G-250 对小肽染色备受青睐。常用的方法是将 2 g 考马斯亮蓝 G-250 溶解在 1 L 蒸馏水中,再加 1 L 1 mol/L 硫酸。搅拌 3 小时后过滤,此时溶液为棕色。再加 220 ml 10 mol/L 氢氧化钠。最后,再加 310 ml 100% 三氯醋酸,此时溶液为蓝绿色,备用。将凝胶在 50℃,浸染 3 小时或在室温过夜,就可见到蓝绿色的蛋白带。再用蒸馏水漂洗凝胶约 1 小时,蛋白带更为清晰。使用此方法能将 10~15 个氨基酸的寡肽进行固定和染色。作者曾用此方法检测大米中的醇溶蛋白和低分子质量的蝎毒蛋白,结果是非常理想的。

  的牛血清白蛋白。这个方法接着在 1980 年由 Oakley 等进一步发展以达到简化程序和低消耗的目的。有关这个方法的研究很多,可参见 Dunn 和 Merri 的综述。Ohsawa 等报道了一种改进的银染方法,可检测小至 10-15g ( femtograms, 飞克)的蛋白。由于银染的灵敏度高,各大公司均生产银染试剂盒。银染的机制是将蛋白带上的硝酸银(银离子)还原成金属银,以使银颗粒沉积在蛋白带上。用银染蛋白的吸光度对它们的浓度作图呈现不同的斜率,表明染色的程度是与蛋白中的一些特殊基团有关。研究还表明喊性和含硫氨基酸在银染中的重要性,所以不含或只含很少胱氨酸残基的蛋白质有时是呈负染。目前对银染的详细机制还不是非常清楚。

  在银染过程中,蛋白质首先需要被固定。固定有两个作用,第一是把蛋白固定在凝胶中或至少是阻滞它们在凝胶中的扩散。第二是为了去除干扰染色过程的物质,如去污剂、还原试剂和缓冲液的成分(如甘氨酸)。常用的固定剂有戊二醛、乙醇、甲醇、醋酸以及三氯醋酸, 然后将凝胶放在银染溶液中显色。

  目前的银染方法可以分为两大类,化学显色(chemical development) 和光显色(photodeve lopment)。化学显色方法又进一步分为双胺银染法(diamine silver stains) 和非双胺化学显色银染法(non-diamine chemical development silver stains)。双胺银染色是用氢氧化铵形成银-双胺复合物。将固定后的凝胶浸泡在这个溶液中,并通过酸化(通常用柠檬酸)使其显像,现在被广泛使用。Oakley 和 Wray 的方法即属于这一种。

  非双胺化学显色银染法是将固定的凝胶放在酸性的硝酸银中,在硝酸银和蛋白质发生作用后,在碱性 pH, 用甲醛还原离子化的银成金属银来达到显像的目的。Sammons 等报道的这种方法比 Oakley 等和 Morrissey 的方法灵敏 10 倍,通常用酸化(柠檬酸或醋酸)停止显色。用碳酸钠处理凝胶可以进一步增强染色的强度。

  光显色方法是使用光能还原银离子成金属银。因为光能够在酸性 pH 还原银,所以一旦凝胶被固定,光显色方法染色能使用单一染色溶液,而不像化学染色程序那样通常至少需要两种溶液。

  大部分蛋白使用银染时显示棕色或黑色,但是有一些银染方法会产生各种颜色,而且以此可以辨别不同的蛋白。例如 Goldman 等发现一些脂蛋白呈现蓝色,一些糖蛋白呈现黄、红或棕色。银颗粒由小变大时,颜色可由红/黄通过蓝变成黑。带电氨基酸侧链的变化也是银染颜色变化的关键。此外,银颗粒在凝胶中的分布也会影响显色,所以在电泳带中的蛋白量也是影响因子。

  表 4.11 所示为 Wray 等双胺银染方法,适合于复杂蛋白质混合物。但在大部分情况下采用多色银染,见表 4.12。因为它能提供更多的信息以辨别不同的蛋白。而且由于颜色对比,有时能检测到最小量的蛋白。用这种银染方法有五种基本的色调,黑、蓝、棕、红或黄。这个方法的最大优点是比单色银染更加灵敏。

  由于塑料容器可能有痕量的有机化合物干扰银染色,所以染色过程应采用玻璃容器。另外,水的纯化对银染是至关重要的,表 4.10 和表 4.11 的作者均采用去离子水,但作者在 SDS 凝胶的银染实验中证明需要再用玻璃蒸馏器蒸馏 1~2 次,背景染色会明显降低。要注意试剂纯度,有聚合现象的甲醛、戊二醛不能使用。凝胶最好先照相,再干燥保存。

  银染方法还在不断改进,主要是提高灵敏度、缩短染色时间和简化操作。Berson 使用一个蓝色程序,灵敏度比单用化学显色方法增加 3~7 倍。Blum 等利用改进的银染方法可在 ng 范围内检测植物蛋白、RNA 和 DNA,而且无背景色。Gmnzier 解决了大分子(3 MDa) 的可溶性和银染色问题。Kirkeby 等最近提出了一种染色程序,只在乙醇-醋酸中预固定 10 分钟,再在甲醛和戊二醛溶液中固定 5 分钟,这样就大大缩短了染色过程的时间。Heukeshoven 和作者在 SDS 电泳中所用的银染色全过程只需 1.5~2 小时,实际上用于 SDS 电泳的银染色方法也适用于常规聚丙烯酰胺凝胶电泳,灵敏度可达 1~5 ng。但对 SDS 电泳,检测灵敏度可达 0.3 ng。最近,Swain 等提出一种新的染色程序,可以达到高分辨和无背景色的目的,这些程序将在 “SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳” 中介绍。

  在酸性凝胶中进行组蛋白分离的银染方法可参见 Rabilloud 等使用的程序。

  如果用考马斯亮蓝染色不能检测到蛋白带,而背景十分清晰的情况下,可以再进行银染色。Kmuse 用考马斯亮蓝染色并干燥后的凝胶再进行快速的银染。

  H27N3,在有些情况下也可用于蛋白染色。Lee 用水溶性的苯胺黑对面筋蛋白(gluten protein) 染色比用氨基黑染色更清晰。Coulson 等把它用于检测免疫沉淀反应后的小麦内胚乳蛋白的染色有特殊的优点。Aragancillo 等的实验认为在有些情况下,苯胺黑的染色灵敏度甚至优于氨基黑。丽春红S ( Ponceau S ) 也可用于聚丙烯酰胺凝胶染色,灵敏度为 1~2 μg。它有两种形式:猩红(jana scarlet ) 和酸红(acid red )。Cousden 等认为应使用后一种比较合适。

  快绿 FCF ( Fast Green FCF) 染色对聚丙烯酰胺凝胶电泳后的蛋白定量扫描特别有利。将凝胶浸泡在 1% 的快绿 FCF 溶液(用 7% 醋酸配制)中约 2 小时。用 7% 醋酸脱色,其线 μg 范围内。而在同样情况下使用氨基黑,其线 μg。快绿 FCF 通常用于组蛋白的染色。Gilmore 等用氢氧化钠从染色的蛋白上洗脱快绿,缩短了定量测定的时间,并且不需使用有毒的有机溶剂。Allen 等和 Wilson 也对快绿染色有过报道。

  大家所熟知的蛋白与2,4 -二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene )的反应也能用于蛋白的检测。将凝胶在暗处浸在 2.5% 的 2, 4-二硝基氟苯中约 16 小时,再用盐酸脱色。用这个方法检测牛血清蛋白比氨基黑 10B 灵敏。用此方法还可以直接测定 N 端的氨基酸残基,因而可以得到蛋白质纯度的信息。

  糖蛋白可以通过蛋白或碳水化合物的染色来检测。上述的蛋白染色方法如氨基黑 10B,快绿 FCF,考马斯亮蓝 R-250 都能用于电泳后检测糖蛋白,还有一些方法是基于与糖的部分反应。过去常用的方法是利用品红(fuchsin ) 的高碘酸-希夫氏试剂(periodic-Schiffs reagent ) 染色,简称 PAS 染色。Mathie 等改进了 PAS 染色方法,使染色强度在 2 小时内迅速增强,然后再在 8 小时缓慢增强,改进后的方法其灵敏度比原来高 2 倍。染色带在 520 nm 扫描。不同的糖蛋白其峰的面积和含量的线性关系呈现不同的斜率。所以为了定量需要,要严格使用相应的标准曲线。Wardi 等和 Eckhardt 等也改进了 PAS 方法。前者可检测至 2~3 μg 的糖蛋白,后者则可检测到 40 ng 的糖蛋白。Alcian 蓝(alcian blue ) 染色能用于酸性糖蛋白的检测。

  外源凝集素和碳水化合物的专一相互作用是检测糖蛋白的一种温和的方法。这种方法使用荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate, FITC ) 标记外源凝集素。将凝胶在 pH 7.0 左右在室温下浸 12 小时,用相同的缓冲液脱色。FITC 溶液能被重复使用 3 次。在 4℃,荧光蛋白带至少能在紫外灯下可见一个月。灵敏度约为 100 ng,取决于与外源凝集素结合的碳水化合物。FITC-外源凝集素可以从市场上买到,也可以自己制备。由于基础科学研究的需要和市场的兴趣,关于糖蛋白的结构与功能的研究正受到人们的关注。而荧光标记糖化物的电泳分析是一个高分辨和灵敏的方法,Jackson 对此进行了专门的论述。用荧光方法从糖基检测糖蛋白的方法参见 “荧光探针法”。

  使用丹磺酰肼(dansyl-hydrazine) 的方法可以灵敏地检测低至 40 ng 的碳水化合物。另一种百里酚-硫酸(thymol-sulfuric acid) 方法也具有类似的灵敏度。用荧光标记、放射性标记或酶联反应都可以得到理想的灵敏度。但在聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测糖蛋白最灵敏的方法还是银染色。Dubray 用银染色得到的灵敏度比 PAS 法高 60 倍,最低检测量可低至 0.4 ng。

  Green 等用阳离子碳化青(cationic carbocyanine) 作为磷蛋白的染料。这种染料可以在酸性介质中或有尿素存在时使用。染色后得到蓝色的带可用于扫描。

  P。但在此同时,脂类和核酸也会被标记,所以在电泳前还必须先分离除去,这是一个繁琐的过程。非放射性磷蛋白的测量方法是以释放磷酸盐的陷入(entrapment of liberated phosphate, ELP) 最为常用,它取决于在有氯化钙时,蛋白质磷酸酯键的碱水解产生的不溶性磷酸钙陷入在凝胶中,然后用甲基绿染色。1 nmol/L 的磷酸盐便能给出亮绿的蛋白带。Debmyne 改进的 ELP 方法是基于形成一个不溶性的罗丹明 β-磷钼酸盐(rhodamine β-phosphomolybdate),灵敏度能增加 2~3 倍。虽然银染色方法更灵敏,但是一些非磷蛋白也可能同时被染色。Dahlberg 和 Green 的 stains-all 方法可将磷蛋白染成蓝色,非共轭蛋白染成红色,但是这种方法的专一性不够好,因为糖蛋白、DNA和 RNA 也能被染成蓝色,且灵敏度低于 ELP 方法。用电泳转移和对酸性磷蛋白的三价金属螯合作用也可以检测磷蛋白。

  脂蛋白可以使用常规的染色方法。但为了区别于其他蛋白,通常在电泳前进行预染色。苏丹黑 B (Sudan black B)是常用的染料。电泳后用苏丹黑 B 染色可采用 Prat 的方法。尽管银染色对脂蛋染色缺乏专一性,但它是最灵敏的。

  Smejkal 等报道了一种双染方法,先用染料(filipin) 在 37℃ 染色 5 分钟,可检测低至 20 ng 的低密度脂蛋白,随后再进行考马斯亮蓝染色以检测其他蛋白。这是一种发荧光的染料,灵敏度高,染色速度快,并且不会影响随后的考马斯亮蓝染色,这样便可在一块凝胶上同时检测脂蛋白和其他蛋白。

  血红蛋白,转铁蛋白和其他含铁离子的蛋白能用多种方法检测。Clarke 用含有联苯胺和 0.2 ml 醋酸溶解在 100 ml 水中,再用 30% 过氧化氢处理,30 分钟后出现蓝带。

  4,7-二苯-1,10-菲咯啉(4,7-diphenyl-1,10-phenanthroline)是检测含铁蛋白的灵敏试剂。凝胶被浸在含有 0.01% 菲咯啉和 0.02% 醋酸钠溶液中约 1~2 小时,加 0.1 ml 巯基醋酸盐。几分钟后用 2% 醋酸淋洗凝胶。含铁蛋白呈红色带。

  用普鲁士蓝(Prussian blue) 反应检测铁蛋白的方法相当简便。将凝胶浸在溶于 2% 盐酸中的 2% 普鲁士蓝溶液中约 1 小时,然后用蒸馏水洗脱便可。

  血红蛋白和珠蛋白复合物的染色可以用联苯胺、四甲基联苯胺(如 tetramethylbenzidine ) 和孔雀绿(leucomalachite green) 染色。前二种染料有毒,且四甲基联苯胺染色结果不能保存。孔雀绿染色虽灵敏度不如前者,但操作方便。将 1 g 孔雀绿溶解在 100 ml 冰醋酸和 150 ml 蒸馏水中和锌粉一起煮沸,直至染液无色,保存在 4℃ 备用。将凝胶在染液中染 10 分钟,再转移到 2% 过氧化氢或硼酸钠的饱和溶液中,直至显示出蛋白带为止。

  含铜蛋白可以用茜素蓝S ( alizalin S ) 检测,蓝色的带表示铜的存在。检测含铜蛋白的另一种方法是将凝胶放在 0.2 mol/L 半胱氨酸中约 3 小时。接着再放在含有 0.1% 2,2-奎宁酮(2,2-bisquinoline)的冰醋酸中,品红色表示有铜蛋白的存在。

  Moens 等发展了一种检测后叶激素运载蛋白(neurophysins) 的方法,这种方法是用醛缩品红反应,可专门用于检测高胱氨酸含量的蛋白。

  由于同工酶谱的分析比蛋白电泳谱的分析要容易得多,且同工酶谱在基础研究和农、林、牧、副、渔、医、药、食品分析中应用十分广泛,所以是一种非常有用的检测方法。

  常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的重要特点是在电泳过程中可以保持蛋白质的生物活性,包括酶活性,这就给常规聚丙烯酰胺凝胶电泳的同工酶检测创造了最基本的条件。纵然如此还必须避免电泳过程中由于条件不适而产生的蛋白变性,所以要选择合适的缓冲系统(包括 pH 和离子强度);对热敏感的酶在电泳过程中要使用冷却系统;在结束电泳,关掉电源后,蛋白区带容易扩散,所以必须尽可能快地进行同工酶的染色。

  (1) 经典的同工酶染色是将凝胶切成小块,浸泡在合适的缓冲液中进行扩散洗脱。 酶反应后,可做酶活性的定量测定。这种方法适合大体积的样品的分析。如果活性带紧靠,则会影响分辨率。

  (2) 在有些情况下,由于酶的催化反应使无色的物质化学转换成有色物质,如羧基酯、酰胺和萘酚的磷酸酯它们可分别被作为底物检测酯酶、酰胺酶和磷酸酶。有两种方式进行化学转换:一是将凝胶浸泡在含有底物和重氮盐的溶液中染色;二是先将凝胶浸泡在底物缓冲溶液中,然后再转移到重氮溶液中。前者称为 同步偶联方法(simultaneous coupling method ),后者称为 “温浴后-捕获方法” (postincubation-capture method )。前一种方法较好,因为不容易扩散,并且不需要作再一次保温。

  (3) 底物或引物包含技术(substrate or primer inclusion technique)。有时大分子底物或引物很难进入凝胶,所以大分子底物与酶的反应只能在凝胶表面上进行。为了克服此问题,在灌注凝胶时可以将大分子底物配在凝胶中再进行电泳。电泳后将凝胶浸泡在合适 pH 的缓冲液中,对大分子底物染色。脱色后,有色的带便是有酶活性的带。使用这个技术有两个重要的规则需要注意,即底物在电泳时必须不迁移,不降解。如果核酸被加在聚丙烯酰胺凝胶中,不会出现问题,因为能使蛋白质迁移的合适的凝胶浓度不能使核酸分子移动,所以用 DNA 和 RNA 作为底物使用这种技术可检测核糖核酸酶或作为引物可检测 DNA 聚合酶。

  (4) 指示凝胶技术(indicator gel technique)。这个技术可用于醋酸纤维素膜电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳。如果必须使用大分子底物检测酶活性,可在电泳后使用含有底物的指示胶。在合适的缓冲液及辅助因子中和分离胶的两个表面接触,保温这个 “三明治”,再对分离胶中的酶染色,这个方法使酶带的位置接触染色。指示胶通常由淀粉或琼脂组成,有时还可以用滤纸,很少用聚丙烯酰胺。这个技术也可用于与低分子质量底物结合的酶的检测。

  (5) 在有的情况下酶的检测要通过一个辅助酶的转换而产生颜色。在电泳后检测酶时,酶催化反应介质的 pH 是非常重要的。如果电泳是在远离合适酶反应的 pH 完成的。那么在检测前应将酶放在合适 pH 的冷的缓冲液中,用凝胶扫描仪扫描同工酶谱,其吸收峰面积即表示酶的活性。也可以在缓冲液中洗脱酶带,再在分光光度计上测量酶活性。后者方法麻烦,且不准确。

  经典方法测量酶活性,其酶的量是一个限定因子。在凝胶中测定酶活性,底物必须扩散到凝胶中。底物进入凝胶的比例决定了底物的浓度。如果在保温混合液中,底物浓度逐渐减少,则进入凝胶的底物也会逐渐减少。为了避免这种情况,必须使用大体积的反应混合液。底物的转换开始于底物和酶的接触。在凝胶中某一点底物的浓度决定于底物的比例和酶反应的速率。没有反应的底物分子进入凝胶的深层,由于高酶浓度的影响,它们将很快的转换,所以底物不仅能从凝胶表面直接垂直地和酶带接触,而且能从带的侧面接触。而且酶分子可以在保温时被固定,但也可能在保温时扩散出来,其结果可能在酶带的周围形成一个边缘。这种边缘的形成会引起扫描时的误差,所以酶谱的定量测定不像一般蛋白谱,必须谨慎。当然大部分情况下,电泳带中的酶的含量与峰的面积是有线性关系的。

  Fritz 等在实验中观察乳酸脱氢酶同工酶的量决定于电泳时所加的蛋白量。但是用电泳方法测量的比例和用其他方法得到的结果不同。在聚丙烯酰胺凝胶中,小量的酶显示了相对较高的酶活性,这可能是由于底物和偶联试剂进入较慢。Gremer 等在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶的实验中却没有观察到这种现象,这可能是因为底物、辅酶和偶联试剂等很快进入凝胶的原因。

  脱氢酶类的染色通常是将凝胶浸泡在作为最终电子受体的四唑(鎓)盐 ( tetrazolium salt ) 溶液中,如硝基蓝四唑鎓(nitroblue tetrazolium, NBT), 甲基噻唑四唑鎓(methyl thiazolyl tetrazolim, MTT) 或别的合适的四唑鎓盐而被还原产生有色的甲噆(formazan)。吩嗪硫酸甲醋(phenazine methosulfate, PMS) 有时被作为还原辅酶或酶取代基和四唑鎓之间的氢化物离子载体。因为四唑鎓盐是光敏的,所以需要在暗室中保温。

  水解酶类常常采用在酶反应后能产生颜色或发荧光的产物即具有生色团或荧光团的物质来检测。转移酶类和同分异构酶类不能使用这个方法,通常同时需要一个偶联酶,以检测其混合物。由于偶联酶很难进入聚丙烯酰胺凝胶,仅能在凝胶表面产生颜色,常常用琼脂糖、琼脂或聚酯膜铺在聚丙烯酰胺凝胶表面来完成反应。

  现在酶染色已使用丁子香酚(eugenol) 和四羧酸盐(tetmbase) 来替代有潜在危险的致癌试剂,如联苯胺和 O-联茴香胺(O-dianisidine)。并且越来越普遍的是使用荧光标记物质,如伞形化合物(umbelliferyl) 或丹磺酰衍生物。

  有关同工酶的文章和出版物很多。早在 1970 年 Shaw 等便列示了各种同工酶的染色配方。以后 Harris 和 Hopkinson 也给出了同工酶的染色方法,并且逐年不断增补。有时一种酶可以有几种不同的染色方法。且用于淀粉凝胶的方法可同样用于聚丙烯酰胺凝胶。Rothe 等和 Heeb 等对聚丙烯酰胺凝胶同工酶的染色方法进行了综述。Gaa 等在书中详述了各类同工酶,包括脱氢酶类、过氧化物酶类、转移酶类、还原酶类、水解酶类、磷酸酶类、多肽酶类、蛋白酶类和裂解酶类的染色原理和方法。Homes 等则列示了近二百种同工酶染色方法的文献。

  作者利用同工酶染色的技术曾检测不同种鱼、羊、蜜蜂的各种同工酶,以对它们的分类,遗传变异进行研究。同时利用不同类型化合物对酯酶同工酶活性的抑制程度研究药物的毒理作用和寻找棉铃虫和烟青虫的种群分化及遗传关系。在法医学研究方面,利用酯酶 D 和酸性磷酸酶对人血清进行快速分型。

  有关同工酶染色的技术仍在不断发展。Vargiec 等在变性或不变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳后,用 α-萘吡喃葡萄糖苷(α-naphthylglucopyranoside) 作底物,北京快3,酶反应得到的 α-萘酚用快红B ( fast red B ) 或快蓝 BB ( fast blue BB ) 染色,快速而简单地测定了外-β-1,3-葡聚糖酶(exo-β-1,3-glucanase) 的活性。Kalix 等用含有底物羧甲基-curdlan [一种和染料 Remazol 亮蓝(RBB )交联的多糖 ] 的凝胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳后便可直接得到植物萃取液中多个 β-1,3-葡聚糖酶同工酶带的相对定位,并可同时测定酶活性。β-葡聚糖降解同工酶(β-glucan degrading isozymes) 是大麦中 β-葡聚糖水解的专一酶。对其多型性可用含有  β-葡聚糖(β-glucan) 或地衣多糖(lichenan) 的凝胶电泳后,用刚果红(Congo red) 染色便可得到清晰的同工酶带。利用葡萄糖、果糖、甘露糖和葡萄糖-1-磷酸盐的释放活性,可在电泳后检测糖苷酶和糖基转移酶。

  甘氨酸-N-甲基转移酶(glycine-N-methyl transferase) 是大量存在于哺乳动物肝脏中的一种蛋白。Santos 介绍了一种专一的酶谱检测方法。这是通过甘氨酸的甲基化作用产生的肌氨酸来检测的。

  peyronel 等用偶氮酪蛋白(azocasein) 在电泳后检测蛋白酶,方法十分简单快捷。电泳后将凝胶保温在有三氯醋酸的偶氮酪蛋白溶液中,再用氢氧化钠处理,便可在橙色背景上得到无色的带。凝胶可在三氯醋酸中保存几个月。这个技术对丝氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶和金属蛋白酶的检测可以得到很好的结果。甚至可在 SDS 电泳后检测。灵敏度可达亚微克量水平。

  King 等详细地给出了得到高分辨率瓜氨酸同工酶的各种电泳条件,包括缓冲系统、凝胶配制、样品萃取、电泳条件和定性、定量检测方法。

  Alonso 等用钌红(ruthenium red) 在 20 分钟~1 小时简便并灵敏地检测果胶酯酶(pectin esterase)。作者等用发荧光的伞形化合物检测了人血红蛋白中的酯酶 D 和酸性磷酸酶。Karesen 等通过酯酶和苹果酸脱氢酸的分析来辨别土豆中的胞囊(cast) 和根-团-线虫(root-knot-nematodes)。

  碱性核糖核酸酶的检测可以将含有底物 RNA 和溴化乙锭(ethidium bromide) 的琼脂糖干膜覆盖在凝胶上进行。灵敏度可达 0.5 ng,并可同时进行核糖核酸酶的抑制实验,Randeniya 用酶染和免疫方法检测了松柏醇氧化酶 (coniferylalcohol exidase) 和等电点约为 9 的漆酶(laccases)。

  同工酶染色方法适用于各种电泳,包括常规聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、滴定曲线,有时甚至还适用于 SDS 电泳。

  与同位素标记的放射性检测方法相比,荧光探针方法虽然在灵敏度上稍有逊色,但它标记时不需要合成,检测手段方便,更没有放射性的危险,所以蛋白质检测,甚至核酸检测都尽可能避免使用放射性方法。如核酸定序过去都采用放射自显影方法,而现在则采用激光荧光方法便是实例。

  荧光探针实际上也是一种蛋白染色,其特点是染料本身或反应产物在一定环境中必须是发荧光的。荧光探针方法可分为电泳前预标记和电泳后再标记两种方法。电泳前预标记蛋白的方法最早使用的荧光探剂是丹磺酰氯(dansyl chlride),后来用的比较多的是荧光胺(fluorescamine),全称是 [ 4-phenyl-spiro [ furan-2(3 H),1-phthalan ]-3,3-dione ]。因为游离的荧光胺和它的水解产物都不发荧光,只有当它结合到蛋白质上时才发荧光,这样就不会有荧光背景的问题,所以它最主要的优点是检测灵敏度高,约 5 ng 的蛋白便可在暗室中用紫外灯检测。它的缺点是当它和蛋白质发生反应时,它会转换一个氨基到羧基上,所以会改变蛋白在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳和 SDS 电泳中的迁移率。虽然也有作者观察到此蛋白的迁移率 R

  OPA 和荧光胺也可用于电泳后的蛋白荧光标记。OPA 和 ANS,( 1-苯胺-8-萘碘酸盐,l-aniline-8-naphthalene sulphonate) 可用于制备凝胶电泳后蛋白带的迅速定位。使用 OPA 作荧光探剂的简单方法是将电泳的凝胶浸泡在 β-巯基乙醇溶液(100 ml 0.1 mol/L pH8.5 巴比妥钠缓冲液或磷酸缓冲液含 70~80 μl β-巯基乙醇)中约 10~25 分钟。在 OPA 溶液(在 2 ml 甲醇中加 20 mg OPA ) 中暗环境放置 15 分钟便可用紫外灯在 365 nm 观察荧光带。使用 ANS 的简便方法是将凝胶浸在 0.003% ( W/V)ANS/0.1 mol/L pH6.8 磷酸缓冲液中约 5~10 分钟便可在紫外灯下观察荧光带。但是这种方法不灵敏,大于 20 μg 的蛋白才能呈现荧光。

  利用荧光淬灭的原理也能灵敏地检测蛋白带。有时电泳后用紫外灯也可以直接观察到蛋白带而不需要加任何探剂,但只有富含色氨酸的蛋白才能进行荧光的直接观察。

  正如 “同工酶染色” 所述,目前在同工酶染色中使用荧光标记越来越普遍。作者等即是用发荧光的四甲基伞形化合物的磷酸盐和醋酸盐分别检测酸性磷酸酶和酯酶 D。β-1,3-葡聚糖同工酶和 β-葡聚糖降解同工酶也都可用荧光方法检测。

  由于基础科学研究的需要和市场的兴趣,关于糖化物的结构与功能研究正受到人们的关注。而荧光标记糖化物的电泳分析是一个高分辨和灵敏的方法。Jackson 对此进行了专门的论述。

  利用荧光染色进行蛋白质分析具有高灵敏度、精确定量和线性动态范围宽等特点,并且操作简便,稳定性高,安全。近年来使用的 SYPRO 橙、SYPRO 红 和 SYPRO Ruby 和 Tangerine 是快速高效的荧光染料。特别是最近由 Bell 和 Mackintosh 介绍的 Deep Purple 比 Sypro Ruby 灵敏度高 8 倍,并且背景极低。染色方法参见 “在双向凝胶电泳中的荧光差异技术”。

  虽然荧光检测方法是一种灵敏而又方便的方法,但并没有像考马斯亮蓝、银染和各种同工酶染色那样被广泛采用,这可能是由于保存结果困难且受扫描设备限制的原因,因为照相结果不理想,并且一些商品凝胶扫描仪不能进行荧光扫描。

  目前,荧光技术为基因组学和蛋白质组学研究提供了高灵敏、高通量的手段,所以正在迅猛的发展,请参阅 “荧光染色” 和 “在双向凝胶电泳中的荧光差异技术”。

  只要具有单特异性抗体,使用免疫方法检测是比较简便而又具有专一性的方法。将电泳后的凝胶用含有专一性抗体的溶液浸湿,保温,再用抗 IgG 偶联到辣根过氧化物酶上(horseradish peroxidase)。进一步在 3, 3-二氨基联苯胺 (3,3-diaminobenzidine) 和过氧化氧中保温,抗原-抗体-过氧化酶复合物就像染色的蛋白带一样清晰可见。当然更灵敏的方法是用放射性标记的抗体与凝胶中的抗原反应。采用双抗体方法则更为专一化。

  比较简便的方法是将含有抗体的琼脂糖凝胶直接铺在聚丙烯酰胺凝胶表面,接着进行电泳。抗原从聚丙烯酰胺凝胶中扩散出去和琼脂糖中的抗体发生反应, 产生免疫沉淀谱型,叫做免疫复制(immunoreplica),然后用前述方法染色或用放射性标记的蛋白 A 检测。最近 Flesch 等将细胞表面蛋白进行生物素作用(bio-tinylation) 和免疫沉淀(immunoprecipitation) 后电泳来鉴別细胞表面抗原。

  现在最常用的方法是将电泳分离后的蛋白抗原通过电印迹(electroblotting),转移到一种膜或滤纸上,然后用合适的抗体进行免疫检测(immunoassay),称为免疫印迹(immunoblotting)。一些同工酶染色的方法,也同时采用了免疫转移方法,如松柏醇脱氢酶和漆酶,碱性磷酸酶和 β-葡聚糖降解酶。Kido 等对 Gc 的检测和 Suen 等对抗原俘获(antigen capture) 的检测也采用了免疫转移。

  免疫检测最为简单的方法是将含有抗体的滤纸、醋酸纤维素膜或琼脂糖凝胶直接铺在电泳后的聚丙烯酰胺凝胶上,保温并进行蛋白染色,这个技术称为免疫固定(immunofixation) 或免疫转移(immunotransfer)。作者等用这个技术研究了北京地区人血清 Gc 亚型的频率分布。Amaud 等用这个技术检测了血清中 α

  -蛋白酶抑制剂,并对方法作了改进。Marshall 比较了免疫固定和免疫电泳方法对鉴别血清中单克隆抗体 IgG、IgA 和 IgM 的能力。结果表示当这三种单抗隆抗体在血清中含量低的情况下,免疫固定技术给出高分辨的结果,而免疫电泳给出不明确的结果,并指出免疫固定最好保温在 40℃。

  常规聚丙烯酰胺凝胶电泳后,如果能得到感兴趣的单一蛋白带,可以进一步进行氨基酸的组成分析。

  电泳分离后,水解前,将感兴趣的蛋白质片段洗脱,一般有 5 μg 纯的蛋白质即可以进行氨基酸分析。为考虑聚丙烯酰胺凝胶中不纯物的影响,可以用空白的凝胶片段进行平行分析。电泳分离后的染色蛋白带也可以不进行洗脱,直接用酸水解,约 5~10 nmol/L 的蛋白质便可在氨基酸分析仪上进行分析聚丙烯酰胺凝胶水解时产生大量的氨会妨碍碱性氨基酸的测定并损害仪器。克服的办法 是上样前将酸性水解产物在 5% 碳酸钠中重复冷冻干燥。肽图和氨基酸序列分析通常在 SDS 电泳后进行。请参阅 “电泳后的肽图分析”。

  虽然平板凝胶可存放在含有 7% 醋酸的密封的塑料袋中。但是即使如此也只能保存 1~3 个月,且占有空间太多,不易保管。

  凝胶干燥目前有两种方法,厚度大于约 1.0 mm 的凝胶为防止日后凝胶的龟裂,应该用凝胶干燥仪进行干燥。厚度小于 1.0 mm 的凝胶则可采用自然干燥法。

  采用凝胶干燥仪干燥。一个好的凝胶干燥仪应有足够大的尺寸,内装加热器和定时器,能抽真空。根据进一步处理的需要,可将凝胶干燥在支持膜上或滤纸上。前者透明,后者不透明。

  随着电泳技术的不断发展,薄层平板凝胶正在替代厚胶。在凝胶干燥保存这一点上,薄胶也体现了它的优点。不需要用凝胶干燥仪,采用自然干燥方法也可以长期保存而不会龟裂。通常将凝胶浸泡在用脱色液配制的 3%~10% 的甘油溶液中约半小时左右,视凝胶的 pH,浓度和厚度而定。将带有支持膜的凝胶晾在平板玻璃上室温过夜(待凝胶发黏便可,时间视当地的温、湿度而定 ), 用保存液浸湿过的玻璃纸或一块透明的塑料膜包在凝胶上,晾干,以上操作避免陷入气泡。如果在上面再压一块玻璃,可使干燥后的凝胶更平整,但会延长干燥时间。对没有支持膜的凝胶在保存液中浸泡后,先将凝胶铺在塑料膜上,再用保存液浸湿的玻璃纸包裹,组成 “三明治”,再用玻璃板压紧,晾干。

  不管是使用凝胶扫描,还是摄录系统,凝胶电泳后通常要进行染色,才能进行定量测定。没有染色的凝胶只能用带有紫外光源的凝胶扫描仪才能定量。 如果电泳后要对样品组分进行定量测定,必须注意以下几点。

  1. 已知和未知样品必须使用相同的溶剂系统,相同的浓度,相同的加样量,并在同一块凝胶上电泳和染色。

  2. 在凝胶上扣除背景常常不像在分光光度计中那么容易,因为后者的样品是溶液,而前者在凝胶上可能脱色不均匀,所以必须按说明书采用合适的方法扣除背景。

  4. 选择合适的染色方法,以使样品的浓度和吸光度的关系在线. 一些畸变的带不能进行准确定量。如由于固定和染色方法不合适或时间不充分而造成蛋白带的中心未被染色;不合适的固定方法和过量加样而造成的 “晕轮” 效应(hob effect);样品没有充分溶解而造成的 “纹理” (streaky) 现象;凝胶聚合不均匀,凝胶中的气泡,电泳时冷却不充分而造成蛋白带的弯曲畸变等。

  如果电泳后进行分子质量的测定,以上因素的影响较小,但仍然要注意。如果定量扫描后进行神经网络分析,电泳操作的影响较大,作者通过对人血清中触珠蛋白电泳图谱的扫描分析和数据处理探索了这方面的技术问题。

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