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实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

发布时间 2020-08-21 05:18

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  实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离血清蛋白质 实验目的 ? ? ? 掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术 了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统(即缓 冲液成分、pH及凝胶孔径不连续)聚丙烯酰胺 凝胶电泳,通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效 应,将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷 多少不同而进行高效分离。 ? 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)的聚合反应: 由单体聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis) 交联而成的三维网状结构凝胶。 Bis:交联剂 过硫酸铵(AP) :引发剂,提供自由基, 引发聚合反应 四甲基乙二胺(TEMED):催化剂, 加快引发 释放自由基的速度 ? 分离机制: 1. 浓缩效应 ?凝胶层孔径不连续:浓缩胶大孔径,分离胶小孔径 ?pH值不连续:电泳缓冲液pH=8.3;浓缩胶pH=6.7; 分离胶pH=8.9 ?缓冲液离子不连续:电泳液中Gly-(慢离子);凝胶中 Cl-(快离子);Pr-介于二者之间 ?电位梯度不连续 成分 pH值 孔径 电泳缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 甘氨酸(慢离子) 蛋白质 Cl-(快离子) Cl-(快离子) 8.3 6.7 6.7 8.9 大 小 有效迁移率 = 迁移率 ? 解离度 电泳时,氯离子跑得 最快,留下一段低电导区, 产生高电位梯度(电位与 电导率成反比),使甘氨 酸离子追赶氯离子,蛋白 质夹在中间而被压缩 2.分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一 定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同 的迁移率 3.电荷效应 电荷量不同,迁移率不同。 实验仪器及试剂 ? 电泳装置 稳压电源 盘状电泳槽 ? 毛细滴管 ? 刻度吸量管 ? 灯泡瓶 ? 玻璃管和橡胶帽 ? 微量移液器 ? 注射器和长针头 ? 脱色摇床 ?Acr和Bis:棕色瓶保存 ? TEMED-四甲基乙二胺,避光保存。 ? 过硫酸铵(新鲜配制) ? 染色液:0.1%溴酚兰液 ? 洗脱液:7%醋酸 ? 其他试剂:见下表贮存液的配制。 贮存液 1 100ml溶液中的含量 1N HCl 48.Oml;Tris 36.6克 TEMED 0.23ml pH 工作溶液配制的体积比 2 3 Acr 28.0克;Bis 0.725克 过硫酸铵 0.14克 1N HCl 48.Oml;Tris 5.98克 TEMED 0.46ml Acr 10.0克;Bis 2.5克 蔗糖 40.0克 电泳槽缓冲液:Tris 0.60克 甘氨酸 2.88克 8.9 分离胶制备: 1份1号,2份2号,1份 水;抽气后加入4份3号 ;凝胶浓度 7%;pH= 8.9 浓缩胶制备: 1份4号,2份5号;抽气 后加入4份6号;凝胶浓 度 2.5%;pH = 6.7 用时可稀释10倍 500ml可供12根电泳管 4 5 6 7 6.7 8.3 实验步骤 1. 每人取电泳管1支,加1滴40%蔗糖于橡胶帽内, 堵住电泳管底部,塞紧。 2. 制备分离胶: (可灌胶12支) 1号2ml 在灯泡瓶中混匀, 用真空泵抽气至 无气泡; 最后加 加3号8ml, 混匀备用 2号4ml 水2ml 3. 分离胶的灌制 用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口2cm处,然 后在距胶面约1cm处,沿玻管壁缓缓加入3-5mm 高的水层,垂直静置至再次出现界面时表明凝胶 已经聚合。 4. 制备浓缩胶:(可灌胶12支) 4号 1ml 5号 2ml 6号 4ml 在灯泡瓶中混匀, 用真空泵抽气至 无气泡; 最后加 加3号1ml, 混匀备用 5. 吸去分离胶上层的水,灌浓缩胶于分离胶上,高约 1.5cm,然后沿管壁小心加入蒸馏水高约0.5cm。垂直 放置至成胶。 6. 成胶后,吸干上层覆盖水;拔去玻棒塞,吸去下层 蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中,装入电泳槽, 然后加入下槽缓冲液,排净管底空气。 7. 样品制备 血清:1-2滴 40%蔗糖:1滴 于EP管中混匀备用 0.05%溴酚兰:1滴 8. 上样 倒入上槽缓冲液盖过玻管上端,排出管内的空 气,检查有无漏液。用微量加样器吸样品液30ul, 加在浓缩胶上。 9. 电泳 上槽——负极;下槽——正极 稳流:1.5mA/管,3min 2.5mA/管,约1h,至玻管3/4处 10. 剥胶 电泳完成后取下玻管,用一长针头注射器吸满蒸 馏水为润滑剂,将针头插入玻管内壁和凝胶柱表面 之间,缓缓旋转玻管,一边注水一边使针头呈螺旋 式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压力, 就可将凝胶柱压出玻管。 11. 固定和染色 ? 用7%醋酸固定3min; ? 用0.1%溴酚蓝碱性液染色5min(染色液回收); ? 用洗脱液(7%醋酸)漂洗脱色 12. 观察结果,描出血清电泳区带图谱,分析有无异常 实验结果 — + 注意事项 ? 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂, 对皮肤有刺激作用,注意避免直接接触。 ? 制胶时,要充分摇匀,加速剂TEMED最后加。 ? 注意观察实验现象:分界面,浓缩效应. ? 溴酚蓝染色﹑脱色﹑染液回收。 ? 固体胶切忌倒入水池。 思考题 1. 圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高? 2. 圆盘电泳灌胶时表面要加盖一层水,为什 么?

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