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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质

发布时间 2020-08-21 05:18

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  聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质 【目的】 1 . 掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。 2 .熟悉 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。 【原理】 带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动,澳门赌场,称为电泳。聚丙烯酰胺凝胶电泳( PAGE )就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。在电泳时,蛋白质在介质中的移动速率 与其分子的大小,形状和所带的电荷量有关。 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶,是由丙烯酰胺( Acr )单体和少量交联剂 N,N- 亚 甲基双丙烯酰胺( Bis )在催化剂 过硫酸铵( Ap ) 和加速剂 四甲基乙二胺( TEMED ) 的作用下发生聚合反应而制得的(其化学结构式见第 2 篇第 1 章)。 聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构,其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联 剂的比例来加以控制。根据血清蛋白分子量的大小,学生实验一般选用 7 %聚丙烯酰胺凝胶 分离血清蛋白质。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质(见第 2 篇第 1 章), 使样品分离效果好, 分辨率较高。一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白 质分离出 5 ~ 7 条带,而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来(图 3-4 ), 是 目前较好的支持介质, 应用十分广泛。 图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱 根据凝胶支持物的形状不同,分为垂直板电泳和盘状电泳两种,二者原理相同。本实验采用的 盘状电泳是在直立的玻璃管中,以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物,采用电泳基质 的不连续体系,使样品在不连续的两相间积聚浓缩(浓缩效应)成厚 度 为 10 -2 cm 的起始 区带,然后再利用 分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中 进行电泳分离。 【器材】 1 .电泳仪 直流稳压电源,电压 400 ~ 500V ,电流 50mA 。 2 .垂直管型圆盘电泳装置 目前这类装置的种类很多,可根据不同的实验要求选择其中的一种。这类装置均由两个基本的 部分组成,一部分为载胶玻璃管,须选用内径均匀( 5 ~ 6mm ) , 外径 7 ~ 8mm ,长 80 ~ 100mm 的玻璃管作为材料,也可以使用更细的玻璃管。另一部分为电泳液槽,可分为上下 两槽 。电泳时,上下两槽通过凝胶柱沟通电流(图 3-5 )。 图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A 为正面, B 为剖面 ) 3 .大号试管和中号试管 4 .微量移液器 5 . 5ml 注射器和 9 号注射针头 6 .洗耳球、滤纸条、封口膜等 【试剂】 1 .丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺 一般性的分析工作,用分析纯的 Acr 和 Bis 即可,精细的分析工作,尤其是分子量的测定和 定量分析,需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶,进一步纯化。 2 . N , N , N ', N ' — 四甲基乙二胺( TEMED ) 商品 TEMED 即可,低温,避光保存。 3 . 10% 过硫酸铵溶液( AP , W/V ) 10g 过硫酸铵定容到 10ml ,最好使用新鲜配制的溶液。 4 .染色液 取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ,然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒搅拌,待完全 溶解后,再加入蒸馏水加至 1000ml 。 5 .脱色液的配制 取三氯乙酸 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。 6 .储备液的配制 电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表: Tris 5.98g 缓冲液 1mol/L HCl 48ml PH 6.7 浓缩胶 加蒸馏水至 100ml Acr 30.0g 凝胶储液 Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml Tris 36.3g 缓冲液 1mol/LHCl 48ml PH 8.9 分离胶 加蒸馏水至 100ml Acr 30.0g 凝胶储液 Bis 0.8g 加蒸馏水至 100ml Tris 6g 10 × 电极缓冲液 Gly 28.8g PH 8.3 加蒸馏水至 1000ml 储液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏备用,用时 10 倍稀释,学生用时大约 3 天需更换一次。 7 .凝胶液的配制 分离胶和浓缩胶的配制见下表: 7% 分离胶配制( ml ) 双蒸水 13.5 凝胶储液 7 PH 8.9 缓冲液 7.5 1%TEMED 2 总体积 30 3% 浓缩胶配制( ml ) 双蒸水 5.7 凝胶储液 1 PH 6.7 缓冲液 1.3 1%TEMED 2 总体积 10 8 . 20% 蔗糖 100ml 取蔗糖 20g ,加少许蒸馏水溶解,最后加至 100 ml 。 9 .加样缓冲液的配制 ( PH6.7 ) 取 1mol 盐酸 4.8 ml , Tris 0.6g , 20% 蔗糖溶液 40ml ,加水至 80ml 充分混匀后,再 加入 0.02g 溴酚蓝, 4 ℃ 保存备用。 【操作】 1 .凝胶系统的聚合和制备 一般先制备分离胶,然后再在分离胶上面制作浓缩胶。 ( 1 )电泳玻璃管的准备 取一根洁净的电泳玻璃管,垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中或用封口膜密封,备用。 ( 2 )分离胶(小孔胶)的制备 取分离胶 3ml 放入试管,加入 100μl 10% Ap 溶液混匀后使用。 用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内,当加到液面距离电泳玻璃管上口 2cm 时停 止(约 1.6ml )。注意在加的过程中不要混进空气,用过的注射器和针头要及时用水清洗, 防止堵塞。 再在其上面小心覆盖 0.5cm 高的蒸馏水层(约 0.2ml )以隔绝空气,并防止柱表面的弯月 面。加水过程中不要用力过猛,防止将液面胶液冲起。刚加入水层时在水层和胶面的交接处可 见一明显的折光面,此折光面会逐渐消失,等再次出现时标志分离胶聚合已经开始,应使玻璃 管垂直静置约 15~20 分钟后,完成凝胶的聚合过程。然后用滤纸小心吸去表面的水层,切勿 破坏胶面的完整性。 ( 3 )浓缩胶(大孔胶)的制备 取浓缩胶 1ml 放入试管,加入 50μl 10%Ap 溶液混匀后使用。 用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶的胶面,用滤纸吸取残留的缓冲液,滤纸 尽量不要接触胶表面。 再加入约 1cm 高的浓缩胶(约 0.25ml ),表面也覆盖一层蒸馏水。刚加入水层时在水层和 胶面的交接处可见一明显的折光面,此折光面会逐渐消失,等再次出现时标志浓缩胶聚合已经 开始,聚合 20~30 min 后除去上面的水层,同样不要破坏胶面的完整性。 吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面,再用电泳缓冲液注满至管口,在室温下放置 10~20 min 后即可使用了。 2 .样品的制备和点样 ( 1 )样品的准备:取兔血清 0.5ml ,加入 3ml 加样缓冲液混合。可在 4 ℃ 冰箱保存 2 周。 ( 2 )点样:将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧,防止电泳中产生漏液。然后分别 在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液,下槽的液面应没过玻璃管的下管口(注意不要有气泡 存在)和电极丝;上槽的液面应没过玻璃管口 0.5~ 1cm 。用微量注射器吸取 50μl 样品; 标准蛋白样品 1 份(蛋白质含量 1mg/ml ,溶于加样缓冲液中)小心的加入玻璃管内,注意 不要让样品溢出管口。 4 .电泳 ( 1 )电流电压条件 圆盘电泳:直流稳流电流强度通常为 4mA/ 管 。 ( 2 )电泳时间 一般约需 3 小时。样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约 1cm 处时即可停止电泳。 5 .剥胶 电泳结束后,取下玻璃管,用带长针头的注射器(内盛蒸馏水)从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓 慢插入针头,一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃管 的内壁分开,待水流从另一端流出时,再慢慢将针头退出(注意操作中不要把胶条搅碎)。然 后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压,将胶条从玻璃管中缓慢滑出。 6 .染色和脱色 剥胶完毕后,将胶条放入染色液中过夜( 16 小时以上)。 将胶条以自来水冲洗两次,然后 在脱色液中脱色约 5 分钟,共两次。 7 .结果分析 脱色完全后,从脱色槽中取出凝胶(小心折断或撕裂),观察区带的数量及迁移率。如果需定 量,可进行区带扫描,计算出各区带中蛋白质的含量。 【注意事项】 1 .制胶时必须以封口膜将管下口封严密,加 AP 后立即灌胶。 2 .灌凝胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流的通过。 3 .电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错,以免样品反方向泳动,电泳时应选用合适 的电流、电压,过高或者过低都会影响电泳效果。 4 .电泳时,为保证电泳结果满意,最好使用新稀释的缓冲液。 5 .丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂,对皮肤有刺激作用,操作时宜带手套,纯化应 在通风柜中进行。 【思考题】 1 . 聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物,有何优缺点? 2 . 哪些因素可以影响凝胶的聚合? 3 . 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的 40 %蔗糖溶液?蔗糖及溴酚蓝各有何用途? 附: 1 . 不同浓度 聚丙烯酰胺 凝胶的配制,见表 3 -2 。 表 3-2 不同浓度 聚丙烯酰胺 凝胶的配制 分离胶浓度 试剂名称 储备液 分离 胶 缓冲液 储备液 浓缩 胶 缓冲液 1%TEMED 配制 30ml 不同浓度分离胶液所需试剂量( ml ) 7% 10% 12% 15% 20% 7 10 12 15 20 7.5 7.5 7.5 7.5 7.5 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- 2 2 2 2 2 配制 10ml 3% 浓缩胶 1.0 1.25 2 蒸馏水 13.3 10.3 8.3 5.3 0.3 5.65 以上各液加入后,为了去除抑制凝胶聚合的氧,在加入 Ap 之前应进行抽气处理。 10% 过硫酸胺 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.1 2 .几种染料的性能及染色原理 ( 1 )氨基黑 10B(amino black 10B) C 22 H 13 O 12 N 6 S 3 Na 3 , MW=715,λmax=620 ~ 630mm 。氨基黑是酸性染料,其磺 酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。缺点是灵敏度不太高,对 SDS— 蛋 白质染色效果不好,对不同的蛋白质着色度不同,色调不一(有蓝、黑、棕等)。 ( 2 )考马斯亮蓝 R 250 (Comassie brilliant blue R 250 ) : C 45 H 44 O 7 H 3 S 2 Na , MW=824 , λmax=560 ~ 590mm ,原理与氨基黑相似,灵敏 度比氨基黑高 5 倍。尤其适用于 SDS 电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时, 对高浓度蛋白质的染色不合乎 Beer 定律。 ( 3 )考马斯亮蓝 G 250 : 比考马斯亮蓝 R 250 多 2 个甲基, MW=854 , λmax=590 ~ 610mm 。染色的灵敏度不如 R 250 ,但比氨基黑高 3 倍,优点在于它在三氯乙酸中不溶解成胶体,能选择地染蛋白质而几 乎无本底色。所以常用于需重复性染色和稳定性的染色,适于定量分析。 聚丙烯酰胺不连续盘状电泳和垂直板电泳基本原理是相同的。后者适用于需要对比性分析的样 品的电泳分析。这项电泳技术( PAGE )由于能够使样品区带浓缩变窄,所以分辨力高、设备 简单、样品量小( 1 ~ 100μg );时间短,操作方便,可分离生物大分子的分子大小范围 广泛,可结合 SDS 后进行亚基分析和分子量测定。这种方法目前几乎代替了超速离心沉降 法。 PAGE 的用途较广,对生物大分子能进行分离、定性、定量分析,又能用于制备 mg 水平的材 料。 3 .蛋白质染色方法(表 3-3 ) 表 3-3 蛋白质染色方法 方法 氨基黑 10B 固定液 甲醇或 7% 乙酸 染液 0.1mol/L 氢氧化钠 - 1% 氨基黑 或 7% 乙酸 - 1% 氨基黑 染色时间 5 min (室 温) 2 h (室温) 或 脱色 5% 乙醇,过夜 7% 乙酸,过夜 考马斯亮蓝 R 10% 三氯乙酸 20% 三氯乙酸 -1%R 250 250 考马斯亮蓝 G 10% 乙酸 250 20% 乙酸 - 1%G 250 10min ( 96 ℃) 过夜 10% 三氯乙酸 甲醇 - 水 - 浓 10 min (室 氨水 温) 64 ∶ 36 ∶ 1

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