服务热线
当前位置:主页 > 新闻中心 >

聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理 步骤 详细

发布时间 2020-08-28 06:51

  聚丙烯酰胺凝胶电泳 Polyacrylamide Gel Electrophoresis , P李A莉GE 小 结 1.掌握(不连续)PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合 上海交通大学医学院 思考题 名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比,PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 上海交通大学医学院 讲课内容 1 PAG的组成 2 PAG的聚合 3 PAG的浓度与孔径的关系 4 不连续PAGE 5 PAGE的特点 上海交通大学医学院 一、PAG 的 组成 PAG 是 由 丙 烯 酰 胺 ( acrylamide,Acr) 单 体 和 N,N’- 亚 甲 双 丙 烯 酰 胺 ( N,N,N’,N’methylene bisacrylamide,Bis)交联剂通过自 由基( free radicals)聚合而成的一种多孔三维网 状结构。 Acr + Bis-----? porous matrix 上海交通大学医学院 ? (1)丙烯酰胺(acrylamide,Acr)结构式 上海交通大学医学院 (2)亚甲双丙烯酰胺 (N,N,N’,N’-methylene bisacrylamide,Bis) 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 讲课内容 1 PAG的组成 2 PAG的聚合 3 PAG的浓度与孔径的关系 4 不连续PAGE 5 PAGE的特点 上海交通大学医学院 二、PAG的聚合 polymerization of PAG 需要催化剂(catalyzer)——氧化还原系 统作用,使Acr单体带有游离基(Free radicals ),从而与Bis进行聚合 上海交通大学医学院 (一)化学聚合:AP-TEMED系统 过硫酸胺 [(NH4)2S2O8] (Ammonium persulfate,AP)作为 催化剂,四甲基乙二胺 (-N,N,N,Ntetramethylethylene diamine , TEMED)为 加速剂。 上海交通大学医学院 AP在水溶液中能产生游离基SO42-.,使丙烯 酰胺单体的双键打开,活化形成自由基丙 烯酰胺,然后游离Acr和Bis作用就能聚合 形成凝胶 TEMED的游离碱基能促进AP形成SO42-. 注意: TEMED量多少都会影响催化作用,须在碱性条 件下聚合 分子氧存在,聚合不完全,须去除分子氧,隔绝 氧 升高温度能提高聚合,降低温度能延迟聚合 上海交通大学医学院 (二)光聚合:核黄素-TEMED系统 有痕迹氧存在下,核黄素(riboflavin)在光照 下(可见光或紫外光)分解,其黄素部分被还原成 无色型,但在有氧条件下无色型又被氧化成带有游 离基的黄素,其也能使Acr和Bis聚合形成凝胶。 注意: 分离胶的合成一般采用化学聚合。因为若用光聚 合,凝胶的孔径受光照强度与时间的影响,导致孔 径大小不同,从而影响蛋白质的分离。 上海交通大学医学院 讲课内容 1 PAG的组成 2 PAG的聚合 3 PAG的浓度与孔径的关系 4 不连续PAGE 5 PAGE的特点 上海交通大学医学院 三、PAG的浓度与孔径的关系 the initial concentrations of acrylamide and BIS control the hardness and degree of crosslinking of the gel. PAG孔径的大小主要由Acr和Bis这两种物质的浓 度决定。可以根据要分离物质分子的大小,选择合 适的单体浓度。 Acr/Bis:20~40 完全透明且有弹性 <10 很脆,易碎,不透明 >100 糊状不成形,易破碎 上海交通大学医学院 凝胶总浓度T——100ml凝胶溶液中含有Acr和 Bis的总克数。 T=(a+b)/m×100% T越大,凝胶孔径越小,适用于分离分子量较小 的物质。 T越小,凝胶孔径越大,适用于分离分子量较大 的物质。 上海交通大学医学院 交联度C——Bis占单体与交联剂总量的百分比。 C=b/(a+b)×100% 当T固定时,Bis浓度在5%时孔径最小。 上海交通大学医学院 讲课内容 1 PAG的组成 2 PAG的聚合 3 PAG的浓度与孔径的关系 4 不连续PAGE 5 PAGE的特点 上海交通大学医学院 四、不 连 续 PAGE (Discontinuous PAGE) 按具体操作分 垂直板形电泳 圆盘电泳 按凝胶系统的均匀性分 continuous PAGE discontinuous PAGE 上海交通大学医学院 Schematic of discontinous electrophoresis technique 上海交通大学医学院 Disc-PAGE 电极槽缓冲液通常为pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液 成分 作用 样品 胶 T=3% C=20%单体 欲分离的样品溶液 pH6.7 Tris-HCl缓冲液 混在一起,用光聚合方法聚 合而成的大孔凝胶 有防对流作用 上海交通大学医学院 Disc-PAGE 成分 作用 浓 缩 除不加样品外,其余组成成 样品在此胶中 胶 分同样品胶相同 被浓缩 上海交通大学医学院 Disc-PAGE 成分 作用 分离 胶 T=7%C=2.5%单体溶液 pH8.9 Tris-HCl缓冲液 化学聚合法聚合成小孔胶 主要的电泳分离 部分 上海交通大学医学院 分离原理 1. 浓缩效应 1)凝胶层的不连续性 两层凝胶T与C不同?孔径不同 浓缩胶孔径大,分离胶孔径小,蛋白质在大孔 径浓缩胶中移动,受阻力小,移动速度快。 上海交通大学医学院 2)缓冲液离子成分的不连续性 甘氨酸(pI=6.0)在pH8.3带负电,朝正极 移动,进入浓缩胶(pH6.7),甘氨酸解 离度(?)很小,有效迁移率(M ?)很低, 移动速度较慢,称为慢离子。 HCl 是强电解质,?=1,Cl-有效迁移率大, 移动速度快,称快离子。 蛋白质(pI<6.0)带负电荷,有效迁移率介 于两者之间。 上海交通大学医学院 pH8.3 Tris-Glycine buffer 样品 样品胶 低 甘氨酸 电 导 浓缩胶 蛋白质 区 HCl 分离胶 上海交通大学医学院 3)pH值的不连续性 为了控制慢离子的解离度,从而控制其有 效迁移率,必须使浓缩胶与分离胶之间pH值 有所区别。 上海交通大学医学院 3.分子筛效应与电荷效应 进入分离胶后,Gly-成为快离子 分离胶只有电荷效应和分子筛效应,根据 各蛋白质所带电荷不同、分子大小不同而分 离 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 Load a sample into a polyacrylamide gel electrophoresis well 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 上海交通大学医学院 讲课内容 1 PAG的组成 2 PAG的聚合 3 PAG的浓度与孔径的关系 4 不连续PAGE 5 PAGE的特点 上海交通大学医学院 五、PAGE 的 特 点 1.具有分子筛效应,分辨率高 2.样品不易扩散,用量少,灵敏度可达10-6g 3.化学性质稳定,分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲 水基团 4.凝胶不带电荷,消除了电渗现象 5.机械强度好,有弹性,在一定浓度范围内无色透明 6.网孔可调节 上海交通大学医学院 小 结 1.掌握(不连续)PAGE的原理 2.掌握影响PAGE迁移率的因素 3.掌握PAGE的操作注意点、试剂作用 4.熟悉PAG的聚合 上海交通大学医学院 思考题 名词解释 1.凝胶总浓度 2.交联度 问答题 1.与CAME相比,PAGE有哪些特点。 2.试比较CAME与PAGE操作的区别。 3.简述不连续PAGE的原理。 上海交通大学医学院

澳门赌场反水-官网在线

联系人:李经理 座机:0371-642345388 地址:河南省濮阳市巩义市夹津口工业园
微信二维码