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澳门赌场蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实

发布时间 2020-09-11 07:41

  SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立,1969年由weber和Osborn进一步完善。主要用于(1)蛋白质的分离(2)蛋白质的纯化。

  蛋白质在十二烷基硫酸钠(SDS)和巯基乙醇的作用下,分子中的二硫键还原,氢键等打开,形成按1.4 g SDS/1 g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物,该复合物带负电,故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移,且主要由于凝胶的分子筛作用,迁移速率与蛋白质的分子量大小有关,因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。

  聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统,主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶,配制凝胶的缓冲液,其pH值和离子强度也相应不同,故电泳时,样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动,在分离胶表面形成了一个极薄的层面,大大浓缩了样品的体积,即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。

  1.  30%凝胶贮备液:称取29 g 丙烯酰胺(Acr)和1 g 甲叉-双丙烯酰胺(Bis),加蒸馏水至100 ml,滤纸过滤贮存。

  2.一旦加入TEMED,混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中,为成层胶留有足够空间。用毛细管轻轻在其顶层加入几毫升正丁醇,以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

  3.  聚合完成之后,倒掉覆盖液体,用去离子水洗凝胶上部数次,尽可能用吸水纸吸干顶端的残存液体。

  5.  在成层胶聚合时,将样品与加样缓冲液混匀,100℃加热3 min。

  6.  成层胶聚合完成后,用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺,将凝胶放入电泳槽上。

  8.  电泳:开始时电压为8 V/cm凝胶,染料进入分离胶后,将电压增加到15V/cm凝胶,继续电泳直到染料抵达分离胶底部,断开电源。

  1. 跑SDS-聚丙烯酰胺电泳时恒压不如恒流好控制,电压过高产热过多,电压过低跑得太慢,效果上来说恒流恒压都差不多。

  2. 在SDS-PAGE不连续电泳中,制胶缓冲液使用的是Tris-HCl缓冲系统,浓缩胶是pH6.7,分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中,其pH环境呈弱酸性,因此甘氨酸解离很少,其在电场的作用下,泳动效率低;而Cl–却很高,两者之间形成导电性较低的区带,蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比,这一区带便形成了较高的电压梯度,压着蛋白质分子聚集到一起,浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后,由于胶中pH的增加,呈碱性,甘氨酸大量解离,泳动速率增加,直接紧随氯离子之后,同时由于分离胶孔径的缩小,在电场的作用下,蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以,pH对整个反应体系的影响是至关重要的,实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况,应首要考虑该因素。

  3.  聚丙烯酰胺的充分聚合,可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后,可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4°C冰箱放置,前者易导致凝固不充分,后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天,SDS可水解聚丙烯酰胺。

  4. 用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时,必须同时作标准曲线。不能利用这次的标准曲线作为下次用。并且sDs—PAGE 测定分子量有10%误差,不可完全信任。

  5. 有些蛋白质由亚基(如血红蛋白)或两条以上肽链(Q一胰凝乳蛋白酶)组成的,它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链。因此,对于这一类蛋白质,SDS一聚内烯酰胺凝胶电泳法测定的只是它们的相对分子量。

  (1) 聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体,其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否,与促凝剂及环境密切相关;

  (2)制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.7,分离胶选择pH8.9,选择Tris-HCl系统;(3)TEMED与AP:促凝作用,加速聚丙烯酰胺的凝固;

  (4)十二烷基硫酸钠(SDS):阳离子去污剂,作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

  (1) 还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或β-巯基乙醇)后,蛋白质构象被解离,电荷被中和,形成SDS与蛋白相结合的分子,在电泳中,只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理,样品稀释适当浓度,加入上样Buffer,离心,沸水煮5min,再离心加样;

  (2)。 带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团,得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT,澳门赌场而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺,室温保温30min;

  (3)非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加还原剂,因而蛋白折叠未被破坏,不可作为测定分子量来使用。

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