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澳门赌场SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

发布时间 2020-09-18 13:09

  BasicBiochemistry Experiments, SJTUBiolodogs Only 总蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 一、实验目的 掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯 酰胺(acr)和交联剂 N-甲叉双丙烯聚酰胺(bis)聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。 arc 和bis 单独存在或混合在一起时是稳定的,但在具有自由基团体系时就能聚合。 引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸铵 Ap,催化 剂是四甲基乙二胺(TEMED);光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵,在紫外光 照射下引发自由基团。采用不同浓度的arc, bis, Ap, TEMED 使之聚合,产生不同孔径的 凝胶。因此可以按分离物质的大小,形状来选择凝胶浓度。 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)有圆盘(disc)和垂直板(vertical slab)型之分,但两者的原 理完全相同。由于垂直板型具有板薄,冷却,分辨率高,操作简单,便于比较和扫描等 优点,因而为大多数实验室采用。 十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂,加入到电泳系统中能使蛋白质的氢 键、疏水键打开,并结合到蛋白质分子上(在一定条件下,大多数蛋白质与SDS 的结合 比为1.4g SDS/1g 蛋白质),使各种蛋白质-SDS 复合物都带上了相同密度的负电荷,其 数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量,澳门赌场从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。 这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素,于是根据标准蛋白质相对分子质量的 对数和迁移率所绘制的标准曲线,可求得未知物的相对分子质量。 三、实验试剂与材料 30%Arc-Bis 贮存液:30g Arc, 0.8g Bis, 用去离子水定容到100mL,过滤除去不溶 性物质,用棕色瓶储存放置在4冰箱中。 Tris-HCl1.0M pH=6.8、Tris-HCl 1.5M pH=8.8 10%过硫酸铵溶液 2xSample Loading Buffer:1.52g Tris,20mL 甘油,2.0g SDS,2.0mL 2-巯基乙 Basic Biochemistry Experiments, SJTUBiolodogs Only 醇,1mg 溴酚蓝,用1M HCl 调节pH 至6.8,加蒸馏水稀释到100mL. 电泳缓冲液(Tris-Glycine缓冲液):Tris 6.0g,甘氨酸28.8g,SDS 1.0g,用去离子 水溶解加入盐酸调节pH=8.3,再定容至1L。 考马斯亮蓝染色液:0.25g考马斯亮蓝R-250,加入454mL 50%甲醇溶液(用乙 醇溶液替代)和46mL 冰醋酸。 脱色液:75mL冰醋酸,875mL 水和50mL 甲醇混匀。 ProteinMarker: PageRuler Prestained Protein Ladder。 10. 初生牛血清白蛋白(BSA) ,相对分子质量 69.293kDa(UniProtKB P02769(ALBU_BOVIN)) 四、实验步骤与结果记录 (一)、安装垂直电泳槽 将厚玻璃板和薄玻璃板洗净,将薄玻璃板与厚玻璃板对齐,放置在固定夹中,在桌面上对齐玻璃板下端,然后锁定固定夹。 将固定夹整体放置于制胶架的胶条上,薄玻璃板朝外胶条应保持干净,制胶架水平,厚玻璃板上端用夹子压紧。向玻璃板缝隙中注入1mL 左右去离子水,检查是否 漏液,液面是否水平。若无误则倒出去离子水。制胶架置于水平桌面上 (二)、制备凝胶板 分离胶制备:取50mL小烧杯,按下表依次定量加入如下溶液: 30% Arc-Bis 1.5M Tris-HCl pH=8.8 H2O 10% AP TEMED 2.5mL 1.5mL 2mL 60uL 10uL 加入TEMED之后用枪头充分搅拌,使分离胶均匀尽快取1mL 移液枪吸取液态 分离胶,加入到玻璃板中间缝隙中,加胶高度距样品模板梳齿下端约1cm。然后向缝 隙中轻轻添加1mL 蒸馏水。确认溶液分层界面平整没有气泡。等待约10min 使分离胶 凝固,观察小烧杯中的剩余分离胶当凝固时即可。 倒出分离胶上层的水,用滤纸条深入缝隙内吸干水分。4.浓缩胶的制备:取50mL 小烧杯,按下表依次定量加入以下溶液: 30% Arc-Bis 1.5M Tris-HCl pH=8.8 H2O 10% AP TEMED 400uL 750uL 1800uL 50uL 10uL 加入TEMED之后用枪头充分搅拌,使分离胶均匀尽快取1mL 移液枪吸取液态 Basic Biochemistry Experiments, SJTUBiolodogs Only 分离胶,加入到玻璃板中间缝隙中,至液体到达薄玻璃板顶端。 尽快取模板梳从顶端插入玻璃板之间的缝隙中,至上端与玻璃板上端卡紧。检查梳齿之间是否有气泡。静置等待约10min 待浓缩胶凝固。检查小烧杯中的剩余凝胶 即可。 (三)、样品处理 PrestainedProtein Ladder 不需要处理,BSA 已经经过Sample Loading Buffer 处理。(四)、组装电泳槽并加样 向内槽加入电泳缓冲液至摸过薄玻璃板上端,轻轻将模板梳向上垂直取出,确保取出过程中不要在加样空中产生气泡。 取蛋白质Marker和已处理过的BSA 蛋白样品,按下表依次向每孔加入指定样 本(由于某些加样孔变形没有加样): Well 10Sample Marker BSABSA BSAVolume 2uL 5uL5uL 将电泳支撑架缓缓放入电泳槽中,注意电极方向。向电泳槽外槽中加入电泳缓冲液至与内槽同样高度。盖上电泳槽盖,打开直流稳压电泳仪。 (五)、电泳 开始时调节电泳仪电压为80~100V,保持电流略大于20mA,观察样品浓缩成一条直线。当样品到达分离胶和浓缩胶的分界线mA 以上。 带已经清晰的分离开时即可停止电泳。关闭电泳仪,拆卸电泳槽。(六)染色与脱色 取下凝胶板,用塑料撬片从上端缝隙深入略微用力将两块玻璃板撬开,凝胶保持粘附在厚玻璃板上。使用撬片沿浓缩胶与分离胶的交界处垂直按下切断凝胶,弃去 浓缩胶。 用撬片划开分离胶与玻璃板两侧的链接,用撬片深入凝胶与厚玻璃板之间,用拇指轻按凝胶提起。转移到盛有足够多考马斯亮蓝染液的饭盒中,微波炉高火加热 1min,然后在摇床上染色2~3min。 回收考马斯亮蓝染剂,向饭盒中加入适量的预先配制的脱色液。放入微波炉中Basic Biochemistry Experiments, SJTUBiolodogs Only 高火加热1min 脱色,然后摇床上脱色2~3min。重复本脱色步骤3~4 次,至样本与 marker 条带清晰呈现出来。将凝胶置于白瓷板上拍照保存图片。 五、结果处理与分析 实验中所得的凝胶电泳图片如下: 由胶图可知BSA在样品中的丰度较高,胶图上显示条带较浓。和Protein Ladder 对比,BSA 蛋白略微在70kDa 条带下方,这与其Mr P02769)的实际测量值相符。除此之外在170kDa 之上还存在1 条带,由于BSA 没有多聚现象, 推断这条带可能是由于BSA 样品中存在杂质蛋白导致的。 六、思考与讨论 (一)、思考题 用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇?巯基乙醇作为还原剂还原打断蛋白质肽链内或肽链间的二硫键,使蛋白质肽链舒展, 松散为线性结构便于SDS 与蛋白质结合。 是否所有的蛋白质都可以用SDS-PAGE测定其相对分子质量? 否。1.SDS-PAGE 可以分离的蛋白质大小在15~200kDa,蛋白质过小或者过大在可 用的凝胶浓度内都难以清晰的分离。2.SDS-PAGE 过程中处理蛋白,导致蛋白亚基之间 的弱相互作用丧失,如果蛋白质由多个亚基共同组成,则观测到的将是单个亚基的大小, 需要人工加和才能得到总蛋白的大小。 (二)、讨论与注意事项 液态的acr和bis 均为神经毒剂,对皮肤黏膜有刺激作用,实验时应戴手套、口 罩操作。 Marker BSABSA BSA15kDa 170kDa 130kDa 100kDa 70kDa 55kDa 40kDa 35kDa 25kDa 溴酚蓝 BSA Basic Biochemistry Experiments, SJTUBiolodogs Only 配置凝胶时需按照试剂顺序依次加入,最后加入Ap和催化剂TEMED,才能保证 正确触发凝固。同时,充分的搅拌十分重要,保证加入时凝胶处处均匀,条带才能清晰。 制备凝胶时必须注意每一步都不可以有气泡产生,否则电泳时蛋白样品流经气泡将导致条带参差不齐。 电泳时应将观察溴酚蓝染剂位置,根据相对速度调节电压,在不使Marker条带 弥散模糊的情况下使其条带间隔尽可能拉大,增加蛋白条带的解析度。 染色与脱色时要在微波炉中加入至微沸状态,保证温度接近100,才能充分的染色、脱色,同时,考马斯亮蓝染液和脱色液都必须浸没凝胶,否则高温可能将凝胶烤 焦。脱色过程应相应多重复几次,可以将大部分背景的蓝色褪去。

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