服务热线
当前位置:主页 > 新闻中心 >

澳门赌场SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意

发布时间 2020-09-18 13:09

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的注意._生物学_自然科学_专业资料。3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)? 电流的平方和功率成正比。电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会 导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时,缓冲

  3. 跑第一向时,为什么要设定一个电流的最大值电压(50 μ A/ 胶)? 电流的平方和功率成正比。电流增大,功率增大,放出的热量也随之增大,就会 导致胶条的温度增加。当温度超过 30 摄氏度时,缓冲液里的尿素就容易解离, 产生一些极性分子,从而对等电聚焦产生影响。 4. 跑第一向时,为什么刚开始的电压比较低,而后逐渐增高? 刚开始时,体系内的带电小分子比较多(比如无机盐和双极性分子)。所以在这 个阶段,电流主要是由这些小分子的移动所产生的。由于这些分子质量小,移动 他们不需要很高的电压。当这些小分子移动到他们的目的地时(无机盐移动到极 性相反的电极;两性分子移动到对应的 pH 条带),体系内的蛋白质才开始肩负 起运载电流的任务,逐渐向所对应的 pH 区域移动。 5. 跑第一向时,为什么会产生一条蓝色的条带,并逐渐向酸性端移动? 蓝色条带是缓冲液中痕量的溴酚蓝被聚焦所产生的。溴酚蓝也是 pH 指示剂,当 它移动到酸性区时( pH4 ),颜色会变成黄色。溴酚蓝的这个移动过程大体上发 生在极性小分子的聚焦之后,蛋白质大分子聚焦之前。 6. 跑第一向时,为什么电压总达不到预定值? 当上样量比较大时或体系内盐分比较多时,聚焦的电压有可能达不到所设定的数 值。 7. 跑第一向时,在电压达到预定值后,电流为什么会降低? 当上样量比较少时,所有蛋白在较短的时间内就移动到所对应的 pH 值区域值, 从而变成中性分子。这样,体系的电阻越来越大,在恒定的电压下,电流就会越 来越小。 8. 跑第一向时,为什么在两个电极丝附近有气泡产生? 等电聚焦完成后,所有的蛋白质都移动到了相应的 pI 值区域,而成为中心分子。 这是加在体系上的电压就开始电解水分子,在阳极产生氧气,在阴极产生氢气。 9. 重泡胀缓冲液(rehydration buffer)中的硫脲的作用是什么,双极性分子的作用是 什么? 硫脲的作用是增加蛋白质的溶解性,特别是碱性蛋白的溶解性。双极性分 子的作用也是增加蛋白质的溶解性。当蛋白移动到相应的 pH 值后,就变成了中 性分子。而不带电荷的蛋白质分子容易聚集,从而降低其在随后的二向胶时的迁 移效率,可能会造成竖的脱尾。而硫脲和双极性小分子则会鉴定中性蛋白质之间 的相互作用,防止它们的聚集。 10. 怎样估计 2D 胶上蛋白质点的分子量和 pI 值? 可以用 BioRad 生产的 2D 胶标准蛋白来校准。也可以用体系内已知蛋白来做比 对。 11. 为什么 2D 胶上的蛋白点有横的和竖的脱尾? 横的脱尾可能是: 1 )一向等电聚焦不完全; 2 )某些蛋白质本身的原因(糖蛋 白); 3 )蛋白的丰度太高。竖的脱尾是因为跑二向时,蛋白的溶解度不好。 12. 什么成分会影响 2D 胶的效果? 核酸,盐,去垢剂等等。 13. 2D 胶的上样量应该在什么范围? 上样量和样品有关。样品内蛋白种类多的上样量要大些,这样每个点才有足够的 量被检测到。一般的全细胞裂解体系,上样量大概在 100 微克(银染)到 500 微 克(考染)之间。 14. 我的蛋白质浓度很低,应该用什么方法来浓缩? 蛋白质的浓缩有很多方法。大致有超滤法,沉淀法和透析法。超滤比较温和,对 蛋白质不会有修饰和改变,蛋白的种类一般不会有丢失。它的缺点是总样品的量 可能会减少(被膜所吸附)。另外超滤对样品的要求比较高。甘油,去垢剂都会 堵塞滤膜,影响超滤的效果。沉淀法比较快速,容易操作,对盐,甘油,去垢剂 的耐受性好。缺点是可能会有部分种类的蛋白没有被沉淀下来(丢失)。沉淀法 中,又以 TCA 法最为普遍使用。使用 TCA 法时,一定要用冷的纯丙酮清洗蛋白 沉淀两次,去处残留的 TCA 和其他沉淀下来的杂质。透析法只使用于量比较大 的样品,量小时,操作困难。 透析法可以和超滤法联用。先把样品透析到一个比 较干净的环境( 不含盐,甘油,去垢剂或其它杂质,比如碳酸氢氨溶液),然后 再进行超滤。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 一、目的要求 (1)学习电泳原理和技术 (2)学习和掌握 SDS-聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术 二、实验原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称 Acr)单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺 (简称 Bis)通过化学催化剂(过硫酸铵),四甲基乙二胺(TEMED)作为加速 剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网 状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电 泳一般可分成 12~25 个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离,且分 离效果好。 聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性 人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能: Acr:丙烯酰胺 Bis:甲叉双丙烯酰胺 AP:过硫酸铵——化学催化剂 TEMED:四甲基乙二胺——加速剂 SDS 是一种阴离子去垢剂,SO32-带负电荷。在含有强还原剂的 SDS 溶液中可形 成 SDS-蛋白质复合物。由于结合大量带负电荷的 SDS,好比蛋白质穿上带负电 的―外衣‖,蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间 自身的电荷差异的作用。 三、实验材料 (一)试剂 1、30%丙烯酰胺混合液(Acr:Bis 为 29:1) 称取丙烯酰胺(Acr)29g 及甲叉丙烯 酰胺(Bis)1.0g,用去离子水溶解并稀释至 100ml,贮棕色瓶中于 4℃保存,可 用一个月。 2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液 取 1mol/L HCL 溶液 48ml、三羟甲基甲烷 (Tris)36.6g,加双蒸馏水至 80ml 使其溶解,调 pH 至 8.8,然后用双蒸馏水稀 释至 100ml,置棕色瓶中,4℃贮存。 3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl 缓冲液 取 1mol/L HCL 溶液 48ml,Tris5.98g,加双蒸 馏水至 80ml,调 pH6.8,用双蒸馏水稀释至 100ml,置棕色瓶中,4℃贮存。 4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液 称取 Tris 6g、甘氨酸 28.8g,加蒸馏水 850ml,调 pH 至 8.3,加蒸馏水到 1000ml,4℃贮存。用时可做 10 倍稀释。 5、10% 过硫酸铵(AP)(6)四甲基乙二胺(TEMED)或 β-二甲基氨基丙腈 (DMAPN)。 6、10%SDS(十二烷基磺酸钠) 称取 SDS 10g,加蒸馏水 100ml 使其溶解。 7、四甲基乙二胺(TEMED) 8、上样缓冲液 取 1.0mol/LpH6.8Tris-HCl 缓冲液 6.25ml,蔗糖 10g,SDS 2.3g, 1g/L 溴酚蓝 10ml,加蒸馏水溶解,混合至 100ml。 9、考马斯亮蓝染色试剂 考马斯亮蓝 R250 染色液:浓度为 2.5g/L,用甲醇∶醋 酸∶蒸馏水=5∶1∶5 的溶液配制(V/V)。 10、脱色液:取冰醋酸 7.5ml、甲醇 5ml,加蒸馏水至 100ml。 11、样品:人血清。 12、蛋白质分子量标志物 市售中分子量蛋白质分子量标志物。也可选择 5 种以上 的已知分子量蛋白质自行配制,注意其分子量分布要能满足需要,各种蛋白质的 浓度基本相等。 (二)仪器 圆盘电泳槽(或垂直板电泳槽)、稳压稳流电泳仪 、脱色摇床。 四、实验方法 (一)准备圆盘电泳槽、电泳仪。 (二)凝胶制备 按下表分别配制分离胶和浓缩胶(此量可供 2 人用) 分离胶(12% 5ml) 浓缩胶(5% 2ml) ddH2O 1.6ml 1.4ml 30%混合液 2.0ml 0.33ml 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 1.3ml — 1.0mol/L pH6.8 Tris-HCl — 0.25ml 10%SDS 50l 20l 10%Ap 50l 20l TEMED 4l 4l 注意:边配边平摇烧杯混匀,配好胶后迅速用滴管灌胶 (三)灌胶 1、先将胶管(5х90mm)封好底,将配制好的分离胶液灌注入胶管内,约 70mm 高度(掌握分离胶的高度),在凝胶表面轻轻加一层正丁醇液(约 3~4mm)。 用于隔绝空气,使胶面平整。室温下静置约 30~60min。观察胶和正丁醇之间的 界面,判断胶是否凝固。要在确认分离胶彻底凝固后才开始配制浓缩胶。 2、分离胶凝固好后,倒掉覆盖在分离胶表面的正丁醇,并用去离子水冲洗一 次,倒置吸净残留的水。将配制好的浓缩胶液灌注入胶管内(约 15mm),在凝 胶表面轻轻加一层正丁醇液(约 3~4mm),用于隔绝空气,使胶面平整。室温 下静置约 30~60min。观察胶和正丁醇之间的界面,判断胶是否凝固。胶凝固好 后,倒掉覆盖在胶表面的正丁醇,并用去离子水冲洗一次,倒置吸净残留的水, 准备加样。 (四)样品预处理和加样 1、取血清 0.1ml、上样缓冲液 0.9ml,混匀,在沸水中煮沸 5min。 2、将胶管封底去掉,放入圆盘电泳槽中,套紧,不能有空的孔,将 Tris-甘氨酸 电泳缓冲液加入圆盘电泳 上、下槽中,电泳缓冲液要盖过胶管口,然后用微量加样器(或注射器)将样品 10μl 加到胶管胶面内。 (五)电泳 上槽接负极,下槽接正极,先调电压为 120v/浓缩胶,开始电泳,当 指示染料进入分离胶后,将电压增加到 80v/分离胶胶,继续电泳直至染料抵达距 分离胶下端约 1cm 处,停止电泳,断开电源。电泳时间约 1.0~1.5h。 (六)考马斯亮蓝染色 电泳结束后,取出电泳胶管,用长注射器针剥胶,一边注水一边推胶,直至胶 出。将胶移至大培养皿中,精确量取并记录凝胶长度和指示染料的迁移距离(分 离胶上缘到染料条带中心距离),然后将凝胶板浸入考马斯亮蓝染色液中 0.51h,再用脱色液脱色 1~2 天,至背景无色为止。区带可作定性或定量分析。 (七)校正曲线的数据处理和分子量测定 精确量取并记录染色后凝胶长度、各标 志蛋白质和各待测蛋白质区带的迁移距离(分离胶上缘到各蛋白质区带中心)。 按下式计算各蛋白质的相对迁移率(Rm 值)。 Rm = 在半对数纸上,以各标志蛋白质的 Rm 值为横坐标(普通尺度),相应的分子量 为纵坐标(对数尺刻度)作图,即得分子量校正曲线。根据各待测蛋白质的 Rm 值,查此校正曲线,可求各待测蛋白质的相对分子量。 五、注意事项 1.制胶过程中用正丁醇封住胶面是为了阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作 用。 2.本法也适合于其他生物样品中蛋白质的分析。上样量不宜过大,否则会出现 过载现象。尤其是考马斯亮蓝 R250 染色,在蛋白质浓度过高时,染料与蛋白质 的氨基(-NH)形成的静电键不稳定,其结合不符合 Beer 定律,使蛋白质量不准 确。 3.Acr 和 Bis 有神经毒性,可经皮肤、呼吸道等吸收,故操作时要注意保护。 附表 1 分子量范围与凝胶浓度的关系 蛋白质 核酸(RNA) 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 分子量范围 适用的凝胶浓度/(%) 104 20-30 104 15–20 1-4×104 15-20 104–105 5-10 1-5×104-1×105 10-15 105-2×106 2-2.6 1×105 5-10 5×105 2-5

澳门赌场反水-官网在线

联系人:李经理 座机:0371-642345388 地址:河南省濮阳市巩义市夹津口工业园
微信二维码