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澳门赌场聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋

发布时间 2020-09-18 13:10

  聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质-liuchang_生物学_自然科学_专业资料。实验九:聚丙烯酰胺凝胶电泳法 分离血清蛋白质 教 师:王丽华 实验目的 1、熟悉电泳的基本原理 2、掌握PAGE的基本原理与操作技术 具体安排 ? 上午:制胶、原理讲解 ? 中午:电泳(午

  实验九:聚丙烯酰胺凝胶电泳法 分离血清蛋白质 教 师:王丽华 实验目的 1、熟悉电泳的基本原理 2、掌握PAGE的基本原理与操作技术 具体安排 ? 上午:制胶、原理讲解 ? 中午:电泳(午餐) ? 下午:染色,脱色、观察结果 电泳的基本原理 电泳: 是指带电粒子在电场中向着与其所带相反电荷 的电极方向移动的现象。 应用: 蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离和鉴定。 带电粒子的运动速度----迁移率μ 即带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 μ= Q X r η Q X /6πrη 粒子所带电荷量 电场强度 粒子半径 介质的粘度 影响电泳速度的因素 1、内在因素: 样品自身性质 2、外在因素: 电场 缓冲液 支持介质 内因:待分离大分子的性质 a. 电荷 b. 分子大小 v=QX/6πrη c. 形状 电场(三要素) 电流: μ与电流成正比 电压: μ与电压成正比 常压电泳(100-500V) 高压电泳(500-10000V) 电阻: μ与电阻成反比 缓冲液 为电泳提供了恒定的pH 值和适宜的离子强度 pH: 解离性质 解离程度 运动方向 电荷量 一般所用离子强度为0.02-0.2之间 离子强度: 强度过低,缓冲能力差,难以维持pH恒定,同 时样品扩散严重; 强度过高,减缓样品的迁移率。 支持介质(物) ? 吸附:支持介质对样品的滞留作用,可导致样品的拖尾。 ? 电渗:在电场中液体对固体支持物的相对移动。 当电渗方向与电泳方向一致时,会加快颗粒泳动 速度;反之,当两者方向相反时,会减慢颗粒泳 动速度。 ? 分子筛:是凝胶电泳的一个特性。筛孔越小,则颗粒在 移动的过程中所受到的阻力也就越大。 电泳分类 按支持介质的不同可分为 ⑴ 纸电泳 ⑵ 醋酸纤维薄膜电泳 ⑶ 琼脂糖凝胶电泳 ⑷ 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) ⑸ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE实验原理 聚丙烯酰胺凝胶: 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N,-甲 叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂和加速剂的作用下聚 合而成的三维网状结构的凝胶。 单体 交联剂 催化剂 加速剂 丙烯酰胺(Acr) N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 过硫酸铵/核黄素 N,N,N‘,N’-四甲基乙二胺(TEMED) 丙烯酰胺(Acr) CH2 CH C O NH2 N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) CH2 CH C O NH CH2 NH C O CH CH2 分类(根据有无浓缩效应) 连续电泳: 电泳体系中缓冲液组成、pH值及 凝胶孔径大小都相同。 电荷效应、分子筛效应 不连续电泳:电泳体系中缓冲液组成、pH值 及凝胶孔径大小都不相同。 电荷效应 、分子筛效应、浓缩效应 不连续电泳 分离胶 凝胶孔径 缓冲体系离 子组成 小 Tris-HCl 浓缩胶 大 Tris-HCl 电极缓冲液 —— Tris-Gly pH值 8.9 6.7 8.3 浓缩效应 Tris/甘氨酸 pH 8.3 浓缩胶,大孔胶, Tris-HCl,pH6.7 _ Tris/HCl pH 8.9 1. 2. 凝胶孔径的不连续性 缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 + 快离子(前导离子): 氯离子 Cl慢离子(尾随离子): 甘氨酸根 NH2CH2COO- 样品中蛋白质的泳动速度介于这两种离子之间 3. 电位梯度的不连续性 分子筛效应 分离胶(小孔胶) pH8.9 分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径 的分离胶时,其受阻滞的程度不同而表现出不同 的迁移率。 分离胶,浓缩胶 电荷效应 进入pH8.9的分离胶中,各种蛋白质所带净电荷 量不同而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快; 反之,则慢. 实验操作 一、制胶(本实验的关键步骤) 1、安装玻板: 将洗净的、带白色边条的玻板水平放好,将 U型硅胶密封条摆好。然后,将不带边条的短 玻板盖在U型硅胶密封条上。 2、安装铁夹:用4只铁夹将安装好的玻板夹 好。 注意:1)夹子的作用点应和白色边条重合, 避免夹到边条内侧,造成玻板变形。 2) 玻板下沿的两个夹子尽量下移, 使之能够起到“腿”的作用,保 证玻板处于直立状态。 3、配制聚丙烯酰胺凝胶: 每种试剂用相应的吸量管、滴 管来吸,吸量管上有标记。 不可混用,否则污染试剂,影响 实验结果。 分离胶的配制 小烧杯中按下列顺序加入:(B液有毒性,尽量不 要接触到皮肤) 1——A液(Tris-HCl) 1 ml 2——B液(Acr-Bis) 2 ml 3——蒸馏水 1 ml 4——过硫酸铵 (现配) 5 ml 前面四项加完后,混匀 5——TEMED 1滴(是加速剂, 加入后很快就会凝固,所以最后加,加完后稍事 混匀就灌注) 灌注分离胶 将配制好的分离胶轻轻混匀,注意不要产生气泡 快速倒入电泳槽两玻璃板之间的缝隙中,不要产生 气泡。 液面高度应距离短玻璃板上缘约2-3厘米左右,上 面灌制浓缩胶。 灌制完成,放于水平处不要再动,约15-20分钟可 以聚合(聚合时间与室温和加样准确度有关)。 烧杯中的胶不要扔掉(化学聚合) 聚胶过程讲理论 浓缩胶的配制 另一小烧杯中按下列顺序加入:(D液有毒性,尽 量不要接触到皮肤) 1——C液(Tris-HCl) 2——D液(Acr-Bis) 0.4 ml 0.8ml 3——E液(核黄素) 4——过硫酸铵 5——蒸馏水 0.3 ml 0.6 ml 0.9 ml 混匀 6——TEMED 1-2滴 灌制浓缩胶 轻轻混匀,快速倾倒进玻璃板间的缝隙,液面 高度与矮板相平。 插入样品槽模板(又称梳子),不要带进气泡。 整个装置在紫外线分钟,使浓缩胶充分 聚合(光聚合)。 聚胶过程讲理论 配制样品液 每四组配制一份,再分装成4小份即可。 1——血清 2——C液 3——20%或40%的蔗糖 0.3 ml 1.0 ml 3.0 ml (吸血清的吸量管用后要马上清洗,以免堵塞) 4——0.05%溴芬兰 0.4 ml (思考2:为什么加2、3、4这三种液体?) 安装电泳槽,加入电极缓冲液( F液) 1.除去夹子及密封硅胶条,将玻璃夹板、电泳槽内芯、 有机玻璃平板依次放入槽内。(注意:两玻璃夹板的 矮板应与电泳槽内芯接触。)然后插入楔型板以固定 玻璃夹板。 2. 在外水槽加电泳缓冲液(F液)至槽体一半的位置, 倾斜槽体,使玻璃夹板下沿中的气泡逸出。放正槽 体,继续加注缓冲液,使内外槽F液的水位均超过矮 板,但不能超过高板。 3. 将梳子轻轻取出,让F液进入梳子形成的加样槽中, 准备加样品。 加样 加样:加样器针尖贴着高玻璃板伸到加样槽中 间位置加样,针尖不要扎破下面的胶面。澳门赌场! 加样量:10 ul -50 ul 电泳 1) 加样完毕后,将电泳槽盖好盖,与电泳仪相连接。 2) 电泳仪电压调至最大,电流调到最小,打开电泳 仪开关进行恒流电泳。 3)浓缩胶:30mA(150V) 分离胶:40mA(200V) 加样后马上将微量加样器仔细冲洗多遍,以免血清堵 塞针尖。 观察并记录电泳现象 八、剥胶、染色、脱色 ? 剥胶:拆开电泳槽装置,用竹镊子轻轻撬开两层 玻璃板,戴上一次性手套,用手和镊子将分离胶 剥离到染色液盘内,染色15分钟。 ? 脱色: 将分离胶小心完整地从染色液中移到脱色 液内,脱色三次,每次10分钟(每次更换新鲜脱 色液80-100ml),脱色时在摇床上摇。 PAGE与醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质比较 — + 点样线 清蛋白 血清蛋白质醋酸纤维素薄膜 电泳示意图 聚丙烯酰胺凝胶电泳血清蛋白 质区带分布示意图

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