服务热线
当前位置:主页 > 新闻中心 >

聚丙烯酰胺凝胶电泳(修)

发布时间 2020-09-26 14:22

  聚丙烯酰胺凝胶电泳 生物化学与分子生物学教研室 刘智敏教授 实验目的 1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理; 2. 学习聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法分离 血清蛋白 实验原理 (一)什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) (二)PAGE的分类 (三)PAGE分离蛋白质的原理 (四)PAGE的优缺点及其用途 (一)什么是聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylaminde gel electrophoresis, PAGE ) PAGE是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介 质的一种常用电泳技术。 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和甲叉双丙 烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化 完成。 催化聚合的常用方法有两种:化学聚合 法和光聚合法。前者以过硫酸铵(AP)为 催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加 速剂。聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵 产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合, 同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生 甲叉键交联,从而形成三维网状结构。光 聚合法是以核黄素为催化剂,光照使核黄 素产生自由基从而诱发聚合反应。 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可调,常通过改 变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来进 行控制。低浓度凝胶具有较大的孔径,如 3%的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的 阻碍作用,可用于平板等电聚集、SDS聚丙 烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶或用于DNA分离。 高浓度凝胶孔径较小,对蛋白质有分子筛 的作用,一般用于不同分子量蛋白质的电 泳分离。 (二)聚丙烯酰胺凝胶电泳分类 1. 根据凝胶系统的均匀性,可分为连续性和 不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳。连续性聚丙烯酰 胺凝胶电泳是指整个电泳系统中所用的凝胶网孔、 缓冲液及pH都是相同的,电泳时沿电泳方向的电 势梯度均匀分布,按常规区带电泳施加电压进行 操作,简单易行;不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳 是指系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径,电泳过程中形成的电势梯度不均匀, 能将较稀的样品浓缩成密集的区带,从而提高分 辨率。 2. 根据凝胶溶液和电泳缓冲液对蛋白质构象 的影响,可分为变性电泳和非变性电泳两类。前 者在缓冲系统中加入了SDS或尿素等蛋白变性剂, 在电泳前后,蛋白质都处于变性状态;而后者在 缓冲系统中未加入蛋白质变性剂,因而蛋白质可 以保持原有的天然构象。 3. 根据在缓冲系统中是否加入还原剂β-巯基 乙醇或二硫苏糖醇,可将聚丙烯酰胺凝胶电泳分 为还原电泳和非还原电泳。在前者中蛋白质的二 硫键将被破坏,而在后者中则可以保留。如果蛋 白质的二聚体或寡聚体是由链间二硫键来维系的, 那么用该系统还可以区分目的蛋白的亚基聚合形 式。 4. 根据凝胶形状的不同还可以将聚丙烯酰胺 凝胶电泳分为分为圆盘电泳和平板电泳。前者指 在圆形玻璃管内制胶,电泳后形成的区带为圆盘 状;而后者是指凝胶的形状为平板状,有水平和 垂直两种。平板电泳可同时进行多个样品的比较, 而且还可作双相电泳,分辨率更高。 (三)不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理 该电泳系统由两层不连续聚丙烯酰胺凝胶电 泳组成,上层被称为浓缩胶(stacking or concentration gel);下层为分离胶(separation or resolving gel)。两层凝胶具有不同的胶浓度和 缓冲系统。上层浓缩胶浓度为2~5%,缓冲液pH 为6.8;分离胶的浓度为5~20%,缓冲液pH为8.8。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳具有很高的分辨率, 因为它具有以下三种效应(如图)。 1. 样品浓缩效应 由于浓缩胶孔径大而分离胶 孔径小,带电荷的蛋白质离子在大孔径胶中移动 时阻力小,移动速度大,当它接近小孔径的分离 胶时,遇到的阻力大,移动速度减慢而使样品浓 缩,形成一条狭窄区带。另外,缓冲液离子成分 的不同也促进了样品的浓缩。电泳液中含有甘氨 酸离子、氯离子和蛋白质离子,三种带有同性电 荷。 在一定电场作用下,Cl-泳动速度最快,称 为快离子,泳动率最小的是甘氨酸负离子,称为 慢离子,蛋白质离子的有效迁移率介于二者之间。 一定时间后当电位梯度不大时,Cl-能穿过蛋白 质离子,将蛋白质离子甩到后面,而甘氨酸离子 则落后于蛋白质离子,使蛋白质聚集在Cl-和甘 氨酸离子之间,浓缩成很窄的薄层。 浓缩胶与分离胶pH的不同,保证了样品在浓 缩胶时夹在快慢离子之间。而在分离胶中,pH的 增高可调节慢离子的有效迁移率,使之比各种蛋 白质的有效迁移率都高,这样样品离子的移动不 再受快慢离子界面的影响,而只靠蛋白质的电荷 大小及凝胶的分子筛作用,从而达到分离的目的。 2. 分子筛效应 蛋白质分子在电场中泳动,主要 受两种作用力,即静电引力和介质阻力。静电引 力由蛋白质颗粒本身的带电性质来决定。所受阻 力与凝胶网孔有关。在分离胶中,分子量及构象 不同的蛋白质分子,通过一定孔径凝胶时所受的 阻力不同,从而引起泳动速度的不同。在一定网 孔的凝胶中,即使不同蛋白质分子所带电荷相同, 泳动一定时间后,大分子受网孔阻力大,走在后 面,而小分子受阻力小,走在前面。凝胶的这种 可按大小分离不同分子的能力和现象,称为分子 筛效应。 3. 电荷效应 由于浓缩效应,蛋白质在浓缩胶与 分离胶交界处,被浓缩成狭窄条带,当它们进入 分离胶时,由于电泳处于均一体系,蛋白质分子 所带电荷多少就成为决定其迁移率的主要因素, 因此带电荷多的泳动速度快,带电荷少的泳动速 度慢,从而达到分离的目的。 PAGE的优缺点及其用途 优点:聚丙烯酰胺凝胶电泳是把分子筛效应和电 荷效应结合在一起的一种具有高分辨率的电泳方 法。该凝胶是-C-C-C-结合的一种酰胺多聚物(侧 链上是不活泼的酰胺基,没有其它带电的离子 基),化学上惰性较强,不易产生电渗现象,在 一定浓度范围内透明性好,有弹性,机械强度好, 制成多聚物的再现性高,样品分离重复性好,而 且受pH和温度影响较小,并能通过改变交联度调 节孔径大小范围。 此外,该电泳所需的设备简单,分离时间短, 既适用于小量样品的分离鉴定,也适用于较大量样 品的分离制备。因此该方法可用于蛋白和核酸等生 物大分子的分离、定性及分子量测定,也可用于核 酸序列分析。 缺点:凝胶聚合易受各种因素影响;单体聚丙烯 酰胺及双丙烯酰胺对神经系统和皮肤有毒性作用, TEMED对粘膜和上呼吸道组织及皮肤有很大的破 坏作用。 ☆ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电 泳方法,特别适用于蛋白质纯度鉴定和分子量测 定。SDS-PAGE是在要进行电泳分析的样品中加 入了含阴离子表面活性剂——十二烷基磺酸纳 (SDS)和β-巯基乙醇的样品处理液,SDS可以断 开分子内和分子间的氢健,破坏蛋白质的二、三、 四级结构。 电泳样品加入处理液后,置沸水浴中煮沸3~5 分钟,使SDS与蛋白质充分结合,引起蛋白质变 性、解聚、带上大量同种电荷,形成棒状结构。 样品液中通常加入溴酚蓝燃料,用于控制电泳过 程。此外,样品处理液中还加入了适量蔗糖或甘 油以增大溶液密度,便于加样时样品沉入样品凹 槽底部。 制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选 择适当的分离胶浓度,一般分离大分子量蛋白质 需要使用较低浓度的分离胶;分离小分子量蛋白 质需要使用较高浓度的分离胶。当分离胶聚合以 后,通常要在凝胶上面加上一层约1cm厚的浓缩 胶,并在浓缩胶上插入样品梳,形成上样凹槽。 浓缩胶的pH较低(通常pH6.8)、胶浓度较低 (通常为3~5%),形成的孔径大,各种蛋白质都 可以自由通过,常用于样品进入分离胶前将样品 浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳, 上样后通电即可电泳。 凝胶浓度与分离样品分子量的关系 总胶浓度(%) 20 15 10 8 5 分子量范围(kDa) 5~40 15~40 18~90 30~150 60~220 聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统即连续系统 与不连续系统,不连续系统中存在着三种不连续 即pH不连续、凝胶浓度不连续、溶液离子组成不 连续。样品在电泳过程中首先通过浓缩胶,在进 入分离胶前由于等速电泳现象而被浓缩。进入分 离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用,小分子 的蛋白质容易通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度 快;大分子的蛋白质则受到较大的阻力而被滞后, 这样蛋白质在电泳过程中就会根据各自分子量大 小而被分离。溴酚蓝指示剂为一种小分子物质, 可以自由通过凝胶孔径,用它显示电泳的前沿位 置。 实验仪器与试剂 (一)仪器 电泳仪、垂直板电泳槽、电 泳玻璃板,脱色摇床、真空泵、真空干燥 器、电加热磁力搅拌器、移液管、微量移 液器、烧杯等 (二)试剂 丙稀酰胺单体(丙稀酰胺、 甲叉双丙稀酰胺);过硫酸铵(AP):催 化剂;四甲基乙二胺(TEMED):加速剂; 三羟甲基氨基甲烷(Tris):配缓冲液。 实验步骤 (一)试剂配制 (二)样品制备 (三)夹心式垂直电泳槽的安装 (四)配制、灌注聚丙稀酰胺凝胶 (五)上样、电泳、染色、固定保存 夹心式垂直电泳槽的安装 将梳子放在两块玻璃之间 配制、灌注聚丙稀酰胺凝胶 ? 分离胶的制备 取凝胶储备液9.8ml,分离胶缓冲 液5.0ml,蒸馏水24.5ml,100g/L SDS 0.4ml, TEMED 0.1 ml, 100g/L 过硫酸铵溶液0.2ml, 混匀。 ? 浓缩胶的制备 取凝胶储备液1.7ml,浓缩胶缓冲液 1.25ml,蒸馏水6.8ml,100g/L SDS 0.1ml, TEMED 0.05 ml, 100g/L过硫酸 铵溶液0.1ml, 混匀。C ? 样品处理和加样 取血清0.1ml、上样缓冲液0.9ml, 混匀,在沸水浴煮沸5min。每孔 加样5~10μl。 电泳: 电泳条件 电压:120~140V 电泳时间:100分钟 染色 考马斯亮蓝R250染色(数小时或过夜) 漂洗 用漂洗液漂洗凝胶至背景透明。 主要注意事项 ? 固定电泳槽螺丝要平均用力。 ? 灌胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流 的通过。 ? 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺均有毒,对神 经、皮肤有刺激作用,操作时要小心。 实验内容及安排 1. PAGE 2. 基因组DNA提取及鉴定 3. PCR 4. 双向电泳 5. Western blot 6. 核酸分子的酶切与连接

澳门赌场反水-官网在线

联系人:李经理 座机:0371-642345388 地址:河南省濮阳市巩义市夹津口工业园
微信二维码