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Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)原理、方法

发布时间 2020-10-04 01:47

  1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时预电泳是怎么回事的?预电泳时要加6×DNA上样缓冲液吗?电泳1-2小时再加结合反应产物吗?

  预电泳是除去凝胶中没有聚合的单体和双体和聚合引发剂,提高分辨率,不加任何物质,一般30-60分钟后加样电泳。

  (3) 染色:染色液(1g硝酸银,.5mL37%甲醛,1L双蒸水。现配)染色30min。

  (5) 显影:30g碳酸钠,1.5mL37%甲醛,200uL 10mg/L硫代硫酸钠。显影至清晰带纹出现。

  (6) 用超纯水(比如,NANOpure或Milli-Q纯化)或者是双蒸水作银染。

  (8) 在染色后,水清洗所用时间的长短很重要,用不超过5-10秒的时间清洗胶,然后放入显色溶液中,一般在水里浸一下就好。

  3. 变性PAGE的上样缓冲液配方?如何准备上样的蛋白?是将细胞用超声破碎,还是用细胞裂解液,大多细胞裂解液中均含有SDS,不知有没有用于非变性

  非变性的PAGE buffer就是0.5xTBE,上样缓冲液可以用普通的loading buffer,含有Tris,溴芬兰以及甘油即可,甘油是主要的沉淀作用成分。都可以自己

  4. 做了naive---PAGE没有条带,蛋白质是纯品,分子量很大,怎么回事呢?

  因为分子量很大,8%的胶浓度较合适。加样时加个marker,可以检测胶制备是否有问题。银染方法比较灵敏,如果蛋白是一种酶,且可使某种底物显色的话,可以用活性染色试试,更灵敏。

  1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中,蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关,还和蛋白质的分子量以及分子形状有关,其中蛋白质的等电点是最重要

  2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中,要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性,所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度;

  3. 蛋白质的分子量较大,则电泳时间可以适当延长,以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开,反之亦然;

  4. 变性样品的离子强度不能太高(I0.1mM)。调整样品的PH在4.0左右,这对于能否做好非变性样品非常重要。上样BUFFER 中没有SDS之外,加入样品后不能加热.

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