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变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

发布时间 2020-10-04 01:48

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  1. 用浓氨水将合成的寡核苷睃从可控孔度玻璃拄上洗脱下来。于55℃加热5 h 以上。2. 样品移至离心管中,在Speedvac真空旋转蒸发仪中冻干,沉淀用0.2 ml 的水重悬。

  3. 装好灌胶装置,准备合适的凝胶溶液(表1)。对于10 cm×16 cm×1.6 mm 大小的凝胶,在一个真空过滤瓶中棍合下列成分:

  (5)脱气10 min,加入200 μl10%的过硫酸铵及30 μl 的TEMED。混合后灌胶,室温下让胶聚合30 min 以上。

  4. 拔去梳子,将凝胶板固定在电泳槽上,用1×TBE下缓冲液注满上层及下层槽。

  7. 得到一个清哳的结果约需10 μg(50 μl 重悬样品+50 μl 2×甲酰胺加样缓冲液=每孔100 μl)。

  8. 临加样前用移液器上下吹打TBE缓冲液数次以彻底洗涤样品孔。

  9. 加样,在约5 V/cm2电压降下电泳至溴酚蓝到达胶底部。

  11. 用塑料膜覆盖凝胶,将板翻转,将凝胶的一角揭离玻璃板,放在塑料膜上,再用另一张塑料膜覆盖凝胶。

  12. 将凝胶放在带荧光指示剂的薄层层析板上,用短波紫外灯跟踪观察条带,条带将在绿色背景下显示暗迹。

  13. 一个干净的解剖刀将条带直接切下或用墨水标记后切出,剥去塑料膜,将胶条转移至离心管中。

  15. 将溶液转移至一个干净的离心管中,不要带入丙烯酰胺碎片。

  16. 用等体积的酚抽提1次,氯仿抽提1次,乙醇沉淀,干燥,样品用TE缓冲液或水重悬。

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