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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤

发布时间 2020-11-02 02:08

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳简单原理和步骤_生物学_自然科学_专业资料。实验十五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 . 一、概述 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是蛋 白质分析过程中最常用的技术,通常在电泳分离时, 其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、 分子量

  实验十五、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 . 一、概述 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是蛋 白质分析过程中最常用的技术,通常在电泳分离时, 其迁移率主要取决于蛋白质本身所带的电荷多少、 分子量大小和形态。但如在PAGE中加入阴离子去 污剂SDS, SDS将蛋白质的二硫键、氢键及梳水键 打开,使蛋白质变性, SDS将包裹在变性蛋白表面, 使蛋白质成为刚性分子;同时,由于SDS带有大量 负电荷,使蛋白质本身带有的电荷可忽略。至此情 况下,不同蛋白质分子的迁移率主要决定于带有的 SDS量,即蛋白质分子的大小。因此利用SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。 . 二、试剂 A. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液(Acr和Bis) 称取丙烯 酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加水至100ml,过滤后存 于棕色瓶中,于4℃保存。北京快3, B. 4X分离胶缓冲液 称取Tris 18.17g,加入10%SDS贮备液 4ml,用12mol/L HCl调pH至8,8,定容至100ml。 C. 4X浓缩胶缓冲液 称取Tris 6.06g,加入10%SDS 4ml,用 l2mol/L HCI调pH至6.8,定容至100ml。 D. 10%过硫酸铵 称取过硫酸铵0.5g,加水至5ml。本储存液 应现配现用。 E. 10X电极缓冲液 称取Tris 30g、甘氨酸144g,加入 10%SDSl00ml,定容至1000ml。 F. 2X样品缓冲液 称取蔗糖2g(或甘油2m1),加入10% SDS 2ml,溴酚蓝0.25mg,浓缩胶缓冲液2.5ml、β-巯基乙醇 0.5ml,加水定容至10ml。 G. 染色液 称取考马斯亮蓝R-250 2.5g,加入甲醇450ml,冰 乙酸l00ml、水650ml。 H. 脱色液 甲醇100ml,冰乙酸100ml,加水800m1. . 三、操作步骤 1、分离胶的制备 (1). 根据所分离的蛋白质分子量选择分离胶的浓度,制备不同浓 度的凝胶所需的储备液可参考下表,该配方可配制0.75mm 厚、10cm X 7cm的凝胶。在配制凝胶时,将水、30%Acr 和Bis储液、4X分离胶储液混合完全后,线分钟, 然后加入过硫酸胺和TEMED,立即准备灌制凝胶。 (2). 将混合液充分混合后,缓慢地倒入已经固定在夹心垂直平 板电泳槽里的狭槽中,注意在本操作过程中不能产生任何 气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水。 (3). 置于室温下15-30分钟,使凝胶聚合完全 (在水相和凝胶的交 界处有一明显的亮线)。除去上层水相,然后再用水或浓缩 胶缓冲液(0.125mol/m1Tris-HCI,pH6.8, 0.1%SDS) 洗凝 胶表面,准备灌制浓缩胶。 . 不同浓度凝胶的制备 成 不同浓度所需的储备液体积 份 8.5% 10% 12.5% 15% 17.5% H20 3.5ml 30% Acr和Bis分离胶 2.0ml 4X缓冲液 l.9ml 10% 过硫酸铵 112 u1 TEMED 5 ul 3.1ml 2.5ml 1.8ml 2.4ml 3.Oml 3.7ml 1.9ml 1.9ml 1.9ml 112 ul 112 ul 112 ul 5 ul 5 ul 5 ul 1.2ml 4.3ml 1.9ml 112ul 5ul . 2. 浓缩胶制备的方法 (1). 将丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体储备液 0.6ml,浓缩胶缓冲液888u1、水2ml、10 %过硫酸铵56ul、TEMEDl0ul混合均匀后, 立即灌胶。 (2). 将预先制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中, 然后将所需的样品梳(形成加样孔)插于夹 心槽上部,并上下轻轻拉动梳子,小心地 去除粘附在梳齿顶部的小气泡,待聚合完 全后即可拔去梳子,准备电泳。 . 3. 样品制备及电泳 (1). 样品处理:蛋白质样品和分子量标准蛋白质在 上样电泳前均需变性。通常是将样品蛋白质溶 液与等体积的样品缓冲液混合后置于eppendorf 管中,将混合物置于95-100℃加热5分钟,立即 置于冰上,或于-20℃储存,以便再次分析时使 用。 (2). 上样:样品制备好以后,即可上样电泳。先将 样品梳子移去,用双蒸水淋洗每个样品孔,然 后在样品孔中加入电泳缓冲液,同时在电泳槽 中也加满电泳缓冲液。处理完毕后,根据实验 的需要加样电泳。 (3). 电泳:通常使用稳流的方式进行电泳,电流一 般为18mA,时间大约3-4小时。 . 4、凝胶的染色与脱色 A. 电泳完毕后,倒去电泳缓冲液,取出夹心 槽。小心地取出凝胶,置于染色液中染色 4小时,并不时地轻轻晃动。染色完毕后, 倒去染色液,用少量水淋洗凝胶,然后置 于脱色液中脱色,并轻轻晃动,脱色至蓝 色背景消失为止。此凝胶即可用于分析。 B. 考马斯亮蓝检测灵敏度为0.3-1 ug/蛋白带。 C. 银染检测灵敏度为0.1-1.0 ng/蛋白带,比考 马斯亮蓝检测灵敏度高100-1000倍。 . .

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