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北京快3完整版SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告

发布时间 2020-11-10 23:21

  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验名称 xxx班级: xxx姓名: xxx 同组 xxxx学号: xxxx 日期: 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS- 引言SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳( SDS-PAGE )是目前分离蛋白质亚基并测定 其分子量的常用方法,为检测电泳后凝胶中的蛋白质,一般使用考马斯 。本次实验的目的在于学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理,并掌握聚丙烯酰染色胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质的操作技术。 材料和方法2.1 实验原理 2.1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理 2.1.1.1 性能 聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好,有弹性,透明,相对地化学稳定,对 pH 和温度变化比较稳定,在很多溶剂中不溶,是非离子型的,没有吸附和 电渗作用。通过改变浓度和交联度,可以控制孔径在广泛的范围内变动 并且制备凝胶的重复性好。由于纯度高和不溶性,因此还适于少量样品的制备,不致污染样品。 2.1.1.2 制备原理 聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺( Acr )和交联剂甲叉双丙烯酰胺( Bi 在催化剂的作用下聚合而成。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用 过硫酸铵( AP )或过硫酸钾,此外还需要一种脂肪族叔胺作加速剂,最 有效的加速剂是 四甲基乙二胺(TEMED 由过硫酸铵形成氧的自由基,后者又使单体形成自由基,从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效,所以在低 pH 时,常会延长聚 合时间;分子氧阻止链的延长,妨碍聚合作用;一些金属也能抑制聚合 小时内完成,以便使凝胶的性质稳定。 聚丙烯酰胺凝胶电泳和 SDS -聚丙烯酰胺凝胶电泳有两种系统,即只有 分离胶的连续系统和有浓缩胶与分离胶的不连续系统,不连续系统中最 典型、国内外均广泛使用的是著名的 Ornst ein-Davi pH碱性不连续系 统,其浓缩胶丙烯酰胺浓度为 6.8,分离胶的丙烯酰胺浓度为 12.5 8.8。电极缓冲液的 pH SDS和甘氨酸配制 配胶的缓冲液用Tris HCl配制。 样品在电泳过程中首先通过浓缩胶,在进入分离胶前由于等速电泳现象 、甘氨酸阴离子以及Cl 浓缩。这是由于在电泳缓冲液中主要存在三种阴 离子,蛋白质- SDS 复合物,在浓缩胶的 pH 值下,甘氨酸只有少量的电 离,所以其电泳 最初的迁移速度最ClCl 的电泳迁移率最大。在电场的 作用下,迁移率最小,而 后面形成低离子浓度区域,即低电导区,而低电导区会产生较高 Cl 后面的离子在较高的电场强度作用下会加速移动。达到稳Cl 的电场强度 因此和甘氨酸之间形成稳定移动的界面。而蛋白质- SDSCl 复合物由于定状 的界面附近而被浓缩成很窄的区带(可以被浓Cl 相对量较少,聚集在甘 氨酸和 是快离子(前导离子) Cl ,甘氨酸是慢离子(尾随缩三百倍),所以在 浓缩胶中离子)。 当甘氨酸到达分离胶后,由于分离胶的 pH 值(通常 pH 8.8)较大,甘 的界复合物,甘氨酸和Cl 酸离解度加大,电泳迁移速度变大超过蛋白质 SDS面很快超过蛋白质- SDS 复合物。这时蛋白质- SDS 复合物在分 离胶中以本身的电泳迁移速度进行电泳,向正极移动。由于蛋白质- SDS 复合物在单位长度上带有相等的电荷,所以它们以相等的迁移速度 从浓缩胶进入分离胶,进入分离胶后,由于聚丙烯酰胺的分子筛作用, 小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径,阻力小,迁移速度快;大分 子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后,这样蛋白质在电泳过程中就会根 据其各自分子量的大小而被分离。溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,北京快3,可 以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置。当指示剂到达凝 胶底部时,停止电泳,从平板中取出凝胶。在适当的染色液中(如通常 使用的考马斯亮蓝)染色几个小时,而后过夜脱色。脱色液去除凝胶中 未与蛋白结合的背底染料,这时就可以清晰地观察到凝胶中被染色的蛋 白质区带。通常凝胶制备需要 1.5小时,电泳在 25 30mA下通常需 。色。通常使用的垂直平板电泳可以同时进行多个样品的电泳 2.1.1.3 凝胶浓度和交联度与孔径的关系 凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时 常先用7.5% 的标准凝胶或用 4~10% 的凝胶梯度来试测,而后选出适宜的 凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要,胶太软易断裂,; 2.1.2SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理 蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时,它的迁移率取决于所带净电荷 及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入 SDS 巯基乙醇,则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量,而与所带电荷和形状无关。 在蛋白质溶液中加入 SDS 和巯基乙醇后,巯基乙醇能使蛋白质分子中的 二硫键还原; SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开,并结合到蛋白质分 子上,形成蛋白质 -SDS 复合物。 SDS 与蛋白质的结合带来两个后果:第 一,使各种蛋白质的 SDS- 复合物都带上相同密度的负电荷,掩盖了不同 种类蛋白质间原有的电荷差别,使所有的 SDS- 蛋白质复合物在电泳时都 以同样的电荷/蛋白质比向正极移动;第二, SDS 与蛋白质结合后,还 引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质 -SDS 复合物在凝胶电泳 中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,而只是蛋白质分子量 的函数。 选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物,使其形成 SDS 复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离,分子量小 的物质泳动距离大,分子量大的物质泳动距离小。测定出相对泳动率, 用相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图,它们在一定范围内呈直线 关系。因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。 2.1.3 染色原理 常用的染料主要有氨基黑 10B 、考马斯亮蓝 R250 、考马斯亮蓝 G250 苯胺基-8- 萘磺酸,各有优缺点,本实验选用考马斯亮蓝 R250 ,它的染色 灵敏度比氨基黑高 倍,尤其适用于SDS 电泳微量蛋白质染色。 2.2 实验材料 2.2.1 试剂 所用试剂有 10%SDS 30%凝胶贮液( 29?r-1%Bi )、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、 10% 过硫酸铵、 TEMED pH8.3Tris-Gly 电极缓冲液、上 样缓冲液、蛋白质 Maker 0.25%考马斯亮兰 R250 染色液、甲醇:醋酸 脱色液、异丙醇、 tri s-HCl PH6.8)缓冲液、二硫苏糖醇、去离子水等 2.2.2器材 所用器材有垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、 50ml 小烧杯、 移液枪、枪头、玻璃棒、滤纸、表面皿、手套等。 2.2 实验方法 2.2.1 SDS 聚丙烯酰胺的灌制 按说明安装玻璃板,橡胶条放在两玻璃板之间,确定不漏液,玻璃板放 入电泳槽时,有凹槽的一侧向里,时刻保持玻璃片间的压力。 根据表 制备分离胶溶液,加入TEMED 后迅速旋转混合物,用 1ml 枪将其注入两块玻璃板之间的间隙中(灌制红色板的上边缘)。用枪在聚丙烯酰胺溶液上小心的覆盖一层异丙醇。将凝胶垂直放于室温下。 (丙烯酰胺有神经毒性,故操作时应注意不要吸入其粉末,实验时应戴 手套,剩余的聚丙烯酰胺溶液不要乱扔,待聚合后再处理) 待聚合后( 40min ),倒掉覆盖层,用去离子水清洗凝胶顶部,尽可能倒 掉凝胶上的液体,用滤纸吸干水分。 配置浓缩胶,加完TEMED 后迅速旋转混合,注满玻璃板间隙,插 入梳子(写有 1.5mm 的一侧向里,先插入一侧,在从一侧向另一侧压着 插入,以排除气泡)将胶垂直放置于室温下。约 30min 聚合完成,拔出 梳子(平行拔出),用去离子水冲洗胶孔,再用滤纸吸干水。取出玻璃 板,取下橡胶条。 分离胶与浓缩胶配制组分 10% 分离胶( ml 5%浓缩胶( ml 0.67丙烯酰胺 3.3 30%- 2.5 1.5mol/LTris 1mol/LTris(PH6.8)0.04 10%SDS 0.1 0.04 10%APS 0.13 总体10 2.2.2 电泳 离样品处理:左右, 37 摄氏度摇至 OD600=0.6-0.8 将未加 IPTG 诱导的菌液其余菌液 的上样缓冲液,心部分菌液分装,分别加入适 量不含 DTT DTT,分装菌液离心后分别加入适浓度的 IPTG 20 摄氏 度进行诱导 10h0.5mM 的上样缓冲液。与含DTTDTT 量不含加 20 l10min, 电泳槽中加入300ml 电泳缓冲液,所有样品均需煮沸然后用 诱导样枪依次加入IPTG 诱导前的蛋白样品( 20ul 20ul)、诱导前加 DTT 的(,其余空加入等量的上、蛋白 Maker20ul20ul 后样品()和诱导 样缓冲液。,进行电泳,盖好盖子连接电源(红接红,黑接黑),慢慢调节电压至 90V ,至指示剂的红色条带移除胶体,停止 待指示剂达到分离胶,把电压加到 150V 电泳。 染色、脱色 2.2.3 40ml将胶取出,并在右上角切个角,以标记顺序,放入培养皿中加入约 1h最后把胶取出来沥干水,换一次脱色液每隔放入脱色液中,脱色一 3h,拍照。 结果、、所示。其中凝胶经脱色后观察结果,拍照得到 的电泳条带如图 256 诱导前的蛋白质样品、诱条带为本组样品条带,所对应的样品分别为: 8IPTG 的蛋白质样品。的蛋白质样品、 DTT 加诱导后的蛋白质样品和诱导后加DTT 所对应的样品为缓冲液。 条带Maker 最左端的电泳条带所对应的样品为蛋白质, Marker 为蛋白质 MakerMake 蛋白 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结电泳条带图 讨论4.1 对实验结果的分析及结论 对蛋白质有 IPTG 条带相比 887、条带和 诱导作用,能使蛋白质的构象发生变化,从而更易被染色。条带中最上方的那条带颜色很浅,几乎 没条带相比 68条带和 可以将蛋白质中二硫键的还原,用于阻止蛋白质中的半胱氨酸之有。因为 DTT 从而将大的蛋白质分子打断为 若干小间所形成的蛋白质分子内或分子间二硫键。也间接证明了这条带 中的蛋白质富的蛋白质分子。所以最上方的条带颜色很浅, 含半胱氨酸 等能形成二硫键的氨基酸。电泳条带图示,从蛋白质电泳条带的整体来 看,样品中对比蛋白质 Maker 之间。大部分蛋白质的分子量在 18.4- 116kDa 本次实验的电泳条带比较清晰,北京快3各条带对比明显,比较成功。 4.2影响电泳分离的主要因素 4.2.1 待分离生物大分子的性质 一待分离生 物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。般来说 分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形,则其电泳迁移速度越快。 4.2.2 电场强度 )是每厘米的电位降,也称电位梯度。电场强度越 V/cm电场强度(而造成电泳过程泳速度越快。但增大电场强度会 引起通过介质的电流强度增大,因而引起介质温产生的热量增大。电流 在介质中所做的功绝大部分都转换为热,引起样品分离带这会造成以下 影响:度升高,样品和缓冲离子扩散速度增加,的加宽;产生对流 变性;引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的,所以介质中心温度一般要高于外周,尤其是管状电 泳,由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降,摩擦系数减小, 电泳迁移速度增大,由于中央部分的电泳速度比边缘快,所以电泳分离 带通常呈弓型。降低电流强度,可以减小生热,但会延长电泳时间,引 起待分离生物大分子扩散的增加而影响分离效果。所以电泳实验中要选 择适当的电场强度,同时可以适当冷却降低温度以获得较好的分离效果 4.2.3缓冲液的性质 缓冲液的 pH 值会影响待分离生物大分子的解离程度,从而对其带电性质 产生影响溶液 pH 值距离其等电点愈远,其所带净电荷量就越大,电泳的 速度也就越大,尤其对于蛋白质等两性分子,缓冲液 pH 还会影响到其电 泳方向,当缓冲液 pH 大于蛋白质分子的等电点,蛋白质分子带负电荷, 其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电 荷以及缓冲液 pH 值的稳定性,缓冲液通常要保持一定的离子强度,一般 0.02-0.2,离子强度过低,则缓冲能力差,但如果离子强度过高,会在 待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层(即离子氛),由 于离子氛与待分离分子的移动方向相反,它们之间产生了静电引力,因 而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。 4.2.4 电渗 液体在电场中,对于固体支持介质的相对移动,称为电渗现象。由于支 持介质表面可能会存在一些带电基团,如滤纸表面通常有一些羧基,琼 脂可能会含有一些硫酸基,而玻璃表面通常有 Si-OH 基团等等。这些基 团电离后会使支持介质表面带电,吸附一些带相反电荷的离子,在电场 的作用下向电极方向移动,形成介质表面溶液的流动,这种现象就是电 pH值高于 时,玻璃表面带负电,吸附溶液中的正电离子,引起玻璃表面附近溶液层带正电,在电场的作用下,向负极迁移,带动电极 液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同,则 加快电泳速度;如果相反,则降低电泳速度。 4.2.5 支持介质的筛孔 支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响 在筛孔大的介质中泳动速度快,反之,则泳动速度慢。4.3 凝胶电泳蛋白质染色的其他方法 除了本次实验用的考马斯亮兰染色法之外,实验室常用的凝胶电泳蛋白 质染色的其他方法还有以下几种: 4.3.1银染是迄今为止灵敏度最高的一种染色法。是对 SDS PAGE凝胶中的蛋 其基本原理是银离子与蛋白质分子上的酸基(COO-) 结合 可使蛋白质条带呈现深棕至黑色。银染基本上可以分为酸性和碱性 特别在水不够纯的情况下;费时费力 16h);费用昂贵;需要接触有毒的甲醛 而且核酸、脂多糖、脂类、醣脂类化合物常会对银染染色的结果进行干扰。 4.3.2荧光法 针对考马斯亮兰染色虽然快速但是灵敏度不够 银染法虽然灵敏度高但是背景较高 人们尝试用荧光染料对凝胶中的蛋白质条带进行染色。这些荧光染料有 Fluorescein isothiocyanat dansylchloride, rhodamine isothiocyanat 等。这些荧光染色方法需要在电泳之前荧光染料与一定的功能基团相结合。共价结合的荧光标签在蛋白质检测方面非常敏感 超过了考马斯亮兰。 4.3.3负染的原理主要是有选择的将金属离子沉淀在胶上 这种方法的重复性依赖于许多物理化学因素 例如染色液的pH 胶中阴离子的浓度、温度等 与其他方法相比 该方法允许蛋白质保持完整并有效回收以做进一步的结构和生物学分析。特别是在运用咪唑锌进行负染时 凝胶中锌介导的蛋白质固定是完全可以逆转的 也没有受到有机物的污染 重复性优于用铜或者锌进行的负染。4.4 注意事项 制备凝胶应选用高纯度的试剂,否则会影响凝胶聚合与电泳效果。 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净,在电泳时会 造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离,产生气泡或滑胶;拨胶时凝胶板 易断裂,为防止此现象,所用器材均应严格的清洗。 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时,位置要端正,均匀用力 或用一旋紧固定螺丝,以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流的通过。 凝胶完全聚合后,必须放置 30min 1h,使其充分老化后才能轻轻取出 样品模槽板,切勿破坏加样凹槽底部的平整,以免电泳后区带扭曲。 为防止电泳后区带拖尾,样品中盐离子强度应尽量低,含盐量高的样品 可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过 100 蛋白/100 备浓缩胶。浓缩胶制备后,不能进行预电泳,以充分利用浓缩胶的浓缩效应。 电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错,以免样品反方向泳动, 电泳时应选用合适的电流、电压,过高或者过低都会影响电泳效果。 电泳后,应分别收集上下贮槽的电泳缓冲液,在冰箱贮存,可用 几种SDS-PAGE 蛋白质染色方法的比较 八一农学院学报 ,1993,16(3):32-35. 分子生物学实验指导.SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶电泳蛋白质染色方法研究进展 河南农业科学,2006, (5):8-12.

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