服务热线
当前位置:主页 > 新闻中心 >

聚丙烯酰胺凝胶电泳方法与原理adoc

发布时间 2020-11-10 23:22

  笫八部分 聚丙烯酰胺凝胶电泳一、电泳的原理电泳(electrophoresis)是指带电颗粒在电场中向着与其本身所带电荷相反的电极移动的现象。在生物化学及分子生物学中,主要是根据生物大分子所带电荷的数量及其在分子表面排布的不同来对它们进行分离和鉴定。电泳现象早在1809年就被发现,但将这种现象用于生物化学领域却萌芽于十九世纪初,1907年,有人曾研究过白喉毒素在琼脂中的电泳;1937年,瑞典的Tiselius建立了“移界电泳法”(moving boundary EP),成功地将血清蛋白质分成5个主要成分,即清蛋白、α1-、α2-、β-和γ-球蛋白。其后的几十年,电泳技术发展很快,各种类型的电泳技术相继诞生。以所采用的固体支持物区分,有纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、纤维素或淀粉粉末电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳表1 电泳技术的种类类 别名 称型 式?不用支持体的电泳技术1.? Tiselleas式微量电泳2.? 显微电泳3.? 等电点聚焦电泳4.? 等速电泳5.? 密度梯度电泳??属自由电泳????用支持体的电泳技术1.? 纸上电泳2.? 醋酸纤维薄膜电泳3.? 薄层电泳4.? 非凝胶性支持体区带电泳支持体有:淀粉、纤维素粉、玻璃粉硅胶、合成树脂粉末5.? 凝胶支持体区带电泳(1)淀粉胶(2)聚丙烯酰胺①圆盘电泳法②平板法③SDS-凝胶电泳法(3)琼脂糖凝胶电泳(4)琼脂凝胶电泳包括常压、高压电泳(水平式或垂直式)?水平式或垂直式(平板法、柱形法及线丝法)????垂直式(柱形法)垂直式或水平式垂直式(测分子量)?平板法或柱形法(如免疫电泳)??其他用法1.? 双向电泳2.? 电泳—层析相结合3.? 交叉电泳纸4.? 连续低电泳??等;以电泳形式区分,有在液体介质中进行的,有将支持物做成薄膜或薄层的,有板形或柱形的等(表1)。电泳由于与光学装置、自动记录仪及自动部分收集器结合,又组成了等电点聚焦仪、等速电泳仪等等,80年代末发展起来的毛细管电泳(capillary electrophoresis)是在毛细管中装入缓冲液,在其一端注入样品,在毛细管两端加直流高电压实现对样品的分离…… 这些都极大地发展和扩大了电泳技术的应用范围。电泳按其分离的原理大致可分为四类:区带电泳(zone EP,ZEP)、移界电泳(moving boundary EP,MBEP)、等速电泳(isotachophoresis,ITP)和等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)。现将各种电泳分离原理简单介绍如下:1.区带电泳 如图1(a)所示,不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带,可以用染色等方法显示出来,用光密度计扫描可得到一个个互相分离的峰。电泳的区带随时间延长和距离加大而扩散严重,影响分辨率。加不同的介质可减少扩散,特别是在凝胶中进行,它兼具分子筛的作用,分辨率大大提高,是应用最广泛的电泳技术。2.移界电泳 如图1(b)所示,它只能起到部分分离的作用,如将浓度对距离作图,则得到一个个台阶状的图形,最前面的成分有部分是纯的,其他则互相重叠。各界面可用光学方法显示,这就是Tiselius最早建立的电泳方法。3.等速电泳 如图1(c)所示,在电泳达成平衡后,各区带相随,分成清晰的界面,以等速移动。按距离对浓度作图也是台阶状,但不同于上述移界电泳,它的区带没有重叠,而是分别保持。4. 等电聚焦 如图1(d)所示,由多种具有不同等电点的载体两性电解质在电场中自动形成PH梯度,被分离物则各自移动到其等电点而聚成很窄的区带,分辨率很高。 a b c d图1 不同电泳法的分离原理示意图a.区带电泳;b.移动界面电泳;c.等速电泳;d.等电聚焦电泳技术由于具有快速、简便及高分辨率等优点,其应用十分广泛。从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物,以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位;在生化实验室和生化工业方面应用更为普通;医药部门还用作临床诊断。在各类电泳技术中,尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高,为生物化学,分子生物学的发展作出了重大贡献。本文主要介绍聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理与技术。(一)迁移率(泳动度)1.电泳速度设溶液中有一带有正电荷Q的颗粒,在强度为E的电场影响下移动,带电颗粒所受的力为F=QE。同时此颗粒的移动受到方向相反的摩擦力F1=f v的阻碍,f代表摩擦系数,v代表速度。当这两种力相等时,颗粒以速度v向前迁移(图2)。即QE=f v………………………………………………………………………(1)F′=fvF =QEQF′=fvF =QEQHv+_? 图2 带电颗粒在电场中迁移的受力情况?摩擦系数f和扩散系数D的关系为 f=KT/D………………………………………………………………………(3)其中K为布氏常数,T为绝对温度,因此可以从颗粒的扩散系数求出。根据Stoke定律,一球形分子在溶液中泳动所受的阻力F1=6πrηV…………………………………………………………………(4)r为颗粒半径,η为介质粘度,v为泳动速度。(4)式同F1 = f V式比较可得:f=6πrη……………………………………………………………………(5)(5)式代入(2)式得:V=QE/6πrη……………………………………………………………… (6)由(6)式可知,带电颗粒在电场中的电泳速度v与其所带电荷Q,电场强度E成正比,与颗粒半径r大小,液体粘度系数η成反比。即在同一电场同一介质中的颗粒,如带电荷数不同或颗粒大小不同, 则各自电泳速度不同,因而电泳能使各颗粒分开。2.迁移率颗粒在电场中移动的快慢一般不用电泳速度来表示。因为同一颗粒在不同电场中其电泳速度是不同的,由(2)式或(4)式可见速度是电场强度的函数,V = f(E),用v不能反映颗粒本身的特性。因此,颗粒移动快慢通常用迁移率μ或m来表示。泳动度为带电颗粒在单位电场强度下的电泳速度。即:μ=v/E=(d/t)/(V/l) =dl/Vt(cm2·v-1·s-1) ……………………………(7)d为颗粒泳动距离(cm),l为支持物的有效长度(cm),V为加在支持物两端的实际电压(v), t为通电时间(s) (6)式代入(7):μ=Q/6πrη……………………………………………………………………(8)由(8)式可见,迁移率与带电颗的带电荷数,半径、介质粘度有关,而与电场强度无关。所以说,在确定条件下,某物质的迁移率为常数,是该物质的物化特性常数。3.有效迁移率由迁移率的定义式μ=v/E 可得v =μ E…………………………………………………………………………(9)即电泳速度与迁移率和电场强度成正比。 由于电解质在溶液中不同程度的电离对离子迁移速度影响较大,因此,在实际电泳过程中,离子在电场力作用下电流速度是由下式决定的。v =αμE………………………………………………………………………(10)式中α是电离度,μ是离子迁移率,αμ称为有效迁移率。显然,带电颗粒的有效迁移率大,其电泳速度也就大。 离子有效迁移率在讨论聚丙烯酰胺凝胶电泳时是一个很有用的物理量。因为在粗孔胶中为了保证蛋白质p夹在先行离子Cl-和随后离子甘氨酸根G-之间使蛋白质样品浓缩、压成薄片就必须对粗孔胶设计一个缓冲体系,以使得它维持的PH值所造成的离子解离度,刚好满足如下关系,即αC1- m C1- >αP- m P- >αG- m G-这就是电场强度相同时离子在粗孔胶中实际迁移的顺序。式中的m就是离子迁移率u,之所以变更符号,其原因是它所用的单位常以10-5cm2·V-1·s-1为一个m?单位。 当分离成分电泳到细孔胶后,由于要使蛋白质在这一分离胶中分开成区带,而不使甘氨酸根影响蛋白质的分离,因此需要设计另一个PH缓冲体系,使之满足αC1- m C1->αG mG> αP- m P- 这时随后离子一跃而起超过各种蛋白质。(二)影响电泳的外界因素电泳速度除受颗粒本身的性质如带电性,直径大小等影响外,还受其他外界因素的影响。1.?? 电场(1)????????????? 电场强度(电势梯度)电场强度是指单位长度上的电压降(v/cm)。由(2)式见,电场强度E对泳动速度起着十分重要的作用,电场强度越大,电泳速度越快,单位时间内颗粒迁移的距离就越大,电泳时间就可缩短。根据电场强度的大小可将电泳分为二类:常压电泳(100~500v)与高压电泳(500~1000v),前者电场强度一般为2~10v/cm,后者为20~200v/cm,常压电泳分离时间长,需数小时到数天,多用于分离大分子物质,高压电泳分离时间短,有时仅需数分钟,多用于分离小分子物质。在实际工作中有时需要进行快速电泳,如果没有高压电泳设备,人们往往利用上述原理,把常压电泳槽小型化,缩短支持介质的两端距离。例如将原来两端相距20cm 改为5cm,此时外加电压虽仍是200v,但电场强度则从10v/cm变为40v/cm,这就加快了电泳速度。有时为了使样品迁移率放慢,也可调小电压,降低电势梯度。(2)电极及电极反应电泳的电极材料大都选用铂金丝,铂金丝的安放位置影响电场强度。如两极间铂金丝位置放得不好,电场强度不均匀,常会使电泳谱带弯曲或同一样品的迁移速率不一样。通电过程中电极二端会发生电解反应:正极(氧化极)H2O→2H++1/2O2↑+2e-负极(还原极)2H2O+2e-→2OH-+H2↑因此在电泳过程中,正负极均可看到气体产生(负极有密集的氢气泡,正极有较大的氧气泡),电泳过后,两个电泳槽的PH可相差很大(2~4个?PH)。另外电泳过程中会产生热量,尤其是高压电泳,因此高压电泳槽要附有冷却设备,常压电泳可放在冰箱中降温。2.缓冲液缓冲液的成分及浓度决定并稳定着支持介质的PH和溶液的离子强度,并影响着带电颗粒的迁移率。(1) 成分 通常电泳用的缓冲液有:巴比妥(钠);硼酸(钠);磷酸盐;Tris等。要根据电泳类型和对象选用缓冲液成分,例如用纸电泳分离血清蛋白可选用巴比妥-巴比妥钠缓冲液,而聚丙烯酰胺凝胶电泳分离酶常可用Tris-?甘氨酸缓冲液……。缓冲液成分总的要求:不使样品变性,不改变支持物的理化性质,不影响电泳后染色,有利于电泳的进行及样品的分离。(2)浓度 主要影响溶液的离子强度(μ)。离子强度是离子浓度(Ci)和离子价数(z?i)的函数μ=f(ci、zi)稀溶液的离子强度可用下式计算μ=1/2Σ1SCiZi2式中s表示共有s种离子;Ci为离子的摩尔浓度;zi为离子价数。例如0.01mol/L Na2SO4加0.02mol/L NaCl溶液的离子强度应为:μ=1/2(0.01×12+0.01×22+0.02×12+0.02×12) =0.045离子强度越高,颗粒的迁移速度就越慢。在电解质溶液中,带电荷的颗粒能把一些带有相反电荷的离子吸引在其周围,形成一个离子扩散层。一方面影响颗粒所带的电荷,降低其在电场中的电场力F,从而影响迁移速度(式2);另一方面,当加以电场时,颗粒向与其电荷相反的电极移动,即带正电荷颗粒移向负极,带负电荷颗粒移向正极,离子扩散层由于携带过剩的与颗粒符号相反的电荷,则向相反方向移动,结果因颗粒与离子扩散层之间的静电引力,使颗粒迁移速度减慢。上述(8)式是由理想的绝缘体系推导的,如果考虑离子强度的影响:μ=(Q/6πrη)/(1+kμ1/2r)k为常数,25℃,k=0.33×103,μ为离子强度。缓冲溶液浓度低时,离子强度减少,会影响溶液的导电性,样品分子扩散加重,分辨率下降。因此缓冲液的离子强度应有个适宜的范围,一般控制在0.02~0.2之间。(3)PH溶液的PH值决定了带电颗粒解离的程度,决定了物质所带电荷的性质和数量,也决定了样品的迁移方向。以蛋白质为例,当溶液的PH低于蛋白质等电点时,蛋白质分子带正电荷成为阳离子;当溶液PH大于等电点时,蛋白质分子带负电荷,成为阴离子,PH值离等电点越远,颗粒所带净电荷越多,迁移速度越快,反之越慢。图3表示了不同PH条件下,蛋白质分子带电荷情况及其在电场中运动状态。?PH-H+-H++H+-H++H+-H++H+PH>PI蛋白分子的电荷+H3N-R-COOH+H3N -R-COO-H2N-R-COO-离子形式阳离子 两性离子阴离子在电场中的迁移方向向阴极不迁移向阳极图3 蛋白质分子在不同PH条件下所带电荷及其在电场中迁移方向的示意图?因此,当分离某一蛋白质混合物时,应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差异的PH缓冲液。电泳时,正负电极接线也要随PH变化而变化,例如在碱性条件下,蛋白质带负电荷,正极应接在远离加样品的一方,以使蛋白质在支持物上定向迁移。3.支持物多数电泳都有支持物,如纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,然而支持物的结构与性质对带电颗粒的迁移率有很大影响,主要表现为对样品的吸附,产生电渗与分子筛效应。支持物对样品的吸附,使带电颗粒泳动过程中,摩擦力增加,一方面降低了迁移速度,另一方面导致样品拖尾,故使分辨率下降。在电场中液体对于团体支持物的相对移动称为电渗。例如在纸电泳中,由于组成纸的纤维素带负电荷,因感应相吸而使与纸相接触的水层带正电荷(H3O+),使溶液在电场作用下向负极移动,并带动物质向负极移动。如果样品原来带正电荷应向负极移动,结果由于电渗使样品移动得更快,反之就会变慢,甚至倒退。用PH 8.6的巴比妥缓冲液进行血清纸电泳,在这PH下蛋白质带负电荷应向正极移动,可是r-球蛋白却移向负极,这就是电渗造成的,因为这时溶液向负极流动,对蛋白质颗粒泳动起阻碍作用,又加上r-球蛋白分子颗粒较大,移动慢,电渗作用大于颗粒的泳动力,结果使颗粒后退。纸和淀粉等支持物电渗作用明显,醋酸纤维和聚丙烯酰胺凝胶电渗较小。分子筛是凝胶电泳的一个特性,用来作电泳的凝胶通常具有网状结构且具有弹性的半固体物质,具有分子筛作用,使小颗粒易透过,而大颗粒不易通过,凝胶的分子筛效应对分离样品是有利的。?二、聚丙烯酰胺凝胶的合成、结构与性质1.合成聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(Acrylamide,简称Acr)和交联剂N1,N1-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene bisacrylamide,简称Bis)在催化剂的作用下聚合而成的含酰胺基侧链的脂肪族长链,相邻的两个链通过甲叉桥交链起来,链纵横交错,形成三维网状结构的凝胶(图4)。参与反应的催化剂有二种成分。一是引发剂,它提供原始自由基,通过自由基传递,使丙烯酰胺成为自由基,发动聚合反应;二是加速剂,它加快引发剂释放自由基速度。表2是常用引发剂与加速剂的搭配。过硫酸铵和核黄素分别引发二种不同类型的反应。表2 聚合反应催化剂的搭配引发剂加速剂引发反应(NH4)2S2O3(NH4)2S2O3核 黄 素TEMEDDMAPNTEMED化学聚合化学聚合光聚合TEMED,N,N,N1,N1-tetramethy1ethylenediamine N,N,N1N1-四甲基乙二胺;DMAPN,3-dimethylaminpropionitrile,3-二甲基氨丙腈?化学聚合:过硫酸铵在TEMED或DMAPN的催化下形成氧自由基,进而使单体形成自由基,引发聚合反应。聚丙烯酰胺凝胺的分离胶(小孔胶),就是通过这种化学聚合而合成的。光聚合:核黄素在光下形成无色基,后者被氧再氧化形成自由基,从而引发聚合反应。但过量的氧会阻止链长的增加。此法比上法制得凝胶的胶孔大,因此常作电泳中的浓缩胶。以上的聚合反应,受许多因素的影响。(1)大气氧能淬灭自由基,终止聚合反应,所以反应液应当与空气隔绝。(2)有些材料,如有机玻璃能抑制聚合反应,在有机玻璃容器中,反应液和容器表面接触的一层,不能形成凝胶。(3)某些化学物质可以减慢反应速度,如铁氰化钾。(4)温度影响聚合反应,温度高,反应快;温度低,反应慢。因此在设计电泳器和制备凝胶时,要注意这些因素的影响。图4 丙烯酰胺,N’,N’-甲叉双丙烯酰胺和聚丙烯酰胺的化学结构式2.凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系为了使样品分离得快,操作方便,便于记录结果和保存样本,要求凝胶有一定的物理性质,合适的筛孔,一定的机械强度,良好的透明度。这些性质很大程度上是由凝胶浓度和交联度所决定的。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数称为凝胶浓度,记号为T。T(%)=[Acr(g)+Bis(g)]/V(ml)×100%凝胶溶液中,交联剂占单体加交联剂总量的百分数为交联度,记号为C。C(%)=Bis/(Acr+Bis)×100%凝胶浓度能够在3%~30%中变化,浓度过高时,凝胶硬而脆,容易破碎;浓度太小,凝胶稀软,不易操作。凝胶浓度主要影响筛孔的大小。实验表明,筛孔的平均直径和凝胶浓度的平方根成反比。P=kd/T1/2P.网孔的平均直径;T.多聚体浓度;d.多聚体分子直径(5A);K.常数,假如多聚体链结构近似直角交联的,则K为1.5例如:T=5%时 P=1.5×5A/5%1/2 ≈33.5AT=7%时 P=1.5×5A/7%1/2 ≈28.3A交联度C反映凝胶结构中甲撑桥的密度。交联过高,凝胶是不透明的,并且缺乏弹性;交联过低,呈糜糊状。交联度可以决定筛孔的最大直径。在实验中观察到,要获得透明而有合适机械强度的凝胶,单体用量高时,交联量应减少,单体用量低时,交联剂量应增大。下式是一个要求良好的电泳用凝胶的经验公式。在100ml溶液中:Acr(g)×Bis(g)≈常数(约1.3)凝胶浓度与被分离物的分子量大小关系。大致可用表3表示。表3 分子量范围与凝胶浓度的关系分 子 量 范 围适用的凝胶浓度(%)蛋白质:1041~4×1044×104~1×105 1~5×10575×105 20–3015~2010~155~152~5核 酸:104104~105105~2×10615~205~102~2.6最常用的凝胶,T=7%~7.5%,C=2%~3%,Davis标准凝胶的组成是,T=7.2%,C=2.6%。用此浓度的凝胶分离生物体内的蛋白质能得到较好的结果。当分析一个未知样品时,常常可先用7.2%的标准凝胶或用4%~10%的凝胶梯度来试测,而后选用适宜的胶浓度。用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶,太软,不易操作,最好加入0.5%琼脂糖。在3%凝胶中加入20%蔗糖,也可增加机械强度而又不影响孔径大小。3.聚丙烯酰胺凝胶的性能制作良好的聚丙烯酰胺凝胶与其他凝胶相比有如下优点:(1)聚丙烯酰胺凝胶是人工合成三维网状结构的凝胶,具有分子筛作用,其筛孔的大小可人为控制和调节。并且制备重复性好。(2)聚丙烯酰胺凝胶是碳-碳结构,没有或很少带有极性基因,因而吸附少,电荷作用小,不易和样品相互作用,化学性质比较稳定。(3)凝胶无色透明,适宜用光密度扫描记录结果。且需要样量较少。(4)用途广泛,具有弹性,便于操作,易于保存。由于其具有上述特点,特别适合做区带电泳的支持物,用于酶带的分离以及进行分子量的测定。?三、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的机理聚丙烯酰胺胶电泳体系有二种:连续体系与不连续体系。前者指整个电泳体系中所用的缓冲液成分、PH、凝胶网都相同;后者指在电泳体系中采用两种以上的缓冲液、PH值和孔径。按电泳装置不同又可分为垂直管状(圆盘)电泳和垂直平板电泳。这两种电泳操作方式基本相同,不同的只是用于凝胶的支架或为玻璃管,或为玻璃板。这里以最常用的不连续体系的管型盘状电泳为例,说明凝胶分离蛋白质的机理。??????????????????图5 盘状电泳3种胶的组成(Davis标准状态)?(一)??????????? 盘状电泳凝胶组成?胶组成 缓冲液 T(%) C(%) 阳离子 阴离子 PH电极缓冲液 Tris+ Cly- 8.3样品胶 3.1 20 Tris+ Cl- 6.7浓缩胶 3.1 20 Tris+ Cl- 6.7分离胶 7.2 2.6 Tris+ Cl- 8.9电极缓冲液?图5为聚丙烯酰胺电泳组成示意图。电泳槽与凝胶中缓冲液的成分、PH值和离子强度均不相同。使得盘状电泳过程中有三种物理效应:①样品的浓缩效应;②凝胶的分子筛效应;③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好,分辨率高。下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。 (二)样品分离的机理1.样品的浓缩效应:由于电泳基质的四个不连续性,使样品在电泳开始时,得以浓缩,然后再被分离。(1)凝胶层的不连续性:三层不同的凝胶其作用如下:a.样品胶(sample gel):为大孔胶,用光聚合法制备,样品预先加在其中,起防止对流的作用,避免样品跑到上面的缓冲液中,(目前电泳一般不制作此胶)。b.浓缩胶(stacking gel):为大孔胶,用光聚合法制备,有防止对流作用。样品在其中浓缩,并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。c.分离胶(seperatoing gel):为小孔胶,一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离,也有防对流作用,蛋白质分子在大孔径凝胶中受到的阻力小,移动速度快,进入小孔胶时遇到阻力大,速度就减慢了,由于凝胶的不连续性,在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩,区带变窄。(2)缓冲离子成分的不连续性在电场中如有二种电荷符号相同的离子向同一方向泳动,其迁移率不同,两种离子若能形成界面,则走在前面的离子称为快离子,又称前导离子(leading ion),走在后面的离子称慢离子,又称尾随离子(trailing ion)。为了使样品达到浓缩的目的,需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不同的两种离子,并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相,即在三层凝胶中加入快离子,在电极缓冲液中加入慢离子。为了保持溶液的电中性及一定的PH值,需加入一种与快、慢离子符号相反的离子,称为缓冲配对离子(buffer counter ion),使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中(即三层凝胶及电极缓冲液中)。例如,分离蛋白质样品时,通常用氯根(Cl-)为快离子,甘氨酸根负离子(NH2CH2COO-)为慢离子,三羟甲基氨基甲烷(Tris+)作为缓冲配对离子。图6 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理示意图(a)电泳开始时;(b)样品进入浓缩胶被浓缩成一薄层;(c)样品进入分离胶被分离。电泳开始前(图6A) 慢离子位于两个电极槽中,快离子分布在三层凝胶中,样品在样品胶中,缓冲配对离子位于全部系统中。电泳进行中(图 6B) 快离子与慢离子的界面向下移动。由于选择适当的PH值缓冲液,使蛋白质样品的有效迁移率介于快、慢离子的界面处,而浓缩成为极窄的区带。它们的有效迁移率,按下列次序排列,mclαcl> m pαp> m GαG。样品若是有颜色的,可以看到样品在界面处堆积浓缩成极窄的区带。样品分离(图6C) 当样品达到浓凝胶与分离界面处,离子界面继续前进,蛋白质被留在后面,然后分成多个区带。(3)电位梯度的不连续性电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关,因为电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积,迁移率低的离子,在高电位梯度中可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有相似的速度。vi=miαiE 要v一样 mα低的,E要高在不连续系统中,电位梯度的差异是自动形成的。电泳开始后,由于快离子的迁移率最大,就会很快超过蛋白质,因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。电导与电位梯度是成反比的。V=IR=I ∵L=1/R ∴E=V/l=I/LlV.电压;I.电流;R.电阻;L.电导;E.电位梯度V/l因在串联电路中,电流处处相等,因此,I=ELl, 在低电导区就有较高的电位梯度。高电位梯度低电位梯度电极缓冲液样品胶高电位梯度低电位梯度电极缓冲液样品胶浓缩胶分离胶 快离子慢离子蛋白质图7 不连续系统浓缩效应示意图???????这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质有效迁移率和电位梯度的乘积彼此相等时,(mαE)快=(mαE)p=(mαE)慢=v,则三种离子移动速度相同,在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后,则快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳板移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个迅速移动的界面(图7),由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快慢离子之间,因此也就聚焦在这个移动的界面附近,被浓缩形成一个狭小的中间层。 (4)PH的不连续性在浓缩胶与分离胶之间有PH的不连续性,这是为了控制慢离子的解离度,从而控制其有效迁移率,要求在样品胶和浓缩胶中,慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低,以使样品夹在快、慢离子界面之间,使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高,使样品不再受离子界面的影响。(1)浓缩胶应有的PH值在PH8.0以上时,血清中的蛋白质迁移率在-0.6~-7.5迁移率单位之间,要求甘氨酸的有效迁移率小于-0.6单位。设为-0.5单位,即m GαG=-0.5,已知 m G=-15αG = -0.5/-15 = 1/30又 PH=PKa+1ga/(1-a) 已知,甘氨酸PKa=9.8 与α值一起代入上式,计算出PH为8.3,(2)分离胶应有的PH值在分离胶中要求甘氨酸有效迁移率(m GαG)超过所有蛋白质的有效迁移率,这样甘氨酸的泳动速度即超过所有的蛋白质,使分离胶保持均一的PH及电位梯度,以使蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离。血清中的前清蛋白在7.5%凝胶中迁移率小于-5.0单位,则m GαG至少应为-5.0,即α=1/3 (∵mG=-15 α=-5/-15 = 1/3 ),按 PH=PKa+1g a/(1-a) 计算, PH应为9.5。实际上Davis所用的配方中,分离胶的PH值为8.9,但在电泳分离时,根据实际测定证明与理论计算相符,实际上比原制备时的PH约高出半个PH单位,所以与要求的数值是符合的。2.分子筛效应分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时,受阻滞的程度不同,因此表现出不同的迁移率,即所谓分子筛效应,即使净电荷相似,也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子,也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时,小分子走在前面,大分子走在后面与凝胶层析的分子筛效应相反。3.电荷效应蛋白质混合物在胶界面处被高度浓缩,堆积成层,形成一狭小的高浓度的蛋白质区,但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同,因而迁移率不同。承载有效电荷多的,泳动得快,反之则慢,因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状。在进入分离胶时,此种电荷效应仍起主要作用。综上所述,样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的,电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中进行的。在蛋白质样品进入分离胶时,由于在浓缩胶中的慢离子跑到蛋白质前面去,高电势梯度消失,使蛋白质进入到均一电势梯度和PH的分离胶中。此时,又由于分离胶的孔径小,各蛋白质因分子大小和形状不一样而被这孔径阻滞的程度也不相同,使一些即使是净电荷相同的蛋白质分子也因分子筛效应不同而得到分离。?四、聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作方法(一)管型盘状电泳1.仪器和设备??????????图8 管型盘状电泳槽结构A为正面 B为剖面 (1)分离胶PH8.9 (2)浓缩胶PH6.7 (3)电极缓冲液PH8.3??????????图图9 在玻璃管中装有3层不同的凝胶示意图?电泳槽:盘状电泳槽国内有很多单位生产,也可因地制宜,自己制造,槽大多为圆筒形(图9),也有长方形的,上、下槽分别接铂金丝电极,要注意电极到各胶管的距离相等,以保持各凝胶管的电场一致。电泳仪:国内生产的型号很多,如北京六一仪器厂的DYY-Ⅲ型,电压在0~600v内任意调节,电流输出0~100mA,北京快3这类电泳仪比较恰当。玻璃管:选择粗细均一的圆玻璃管,内径5~7mm左右,管长70~100mm。管口用金刚砂磨平,电泳管的清洁很重要,需浸入10%重铬酸盐-硫酸溶液中清洗,再用蒸馏水彻底淋洗干净,在管中滴入丙酮而后干燥备用。聚胶架:普通试管架式样,有机玻璃制成,架的孔洞内装一乳胶管,要求乳胶管孔内径与玻璃管外径相同或略小。微量注射器或微量进样器:加样时,由于需样品量极小,作定量分析时要求样品量准确,因此最好用25.50或100μl的微量进样器加样,也可用50或100μl加液器代用。普通注射器:主要用于灌胶和剥胶,20~30ml,附加10号不锈钢长针头(约10cm长)。其他:日光台灯,PH计,恒温水浴,烧杯,容量瓶,量筒,试管,漏斗,滤纸,电炉,电子天平等。2.试剂 甲叉双丙烯酰胺(Bis);丙烯酰胺(Acr);四甲基乙二胺(TEMED);过硫酸铵;核黄素(VB2);三羟甲基氨基甲烷(Tris);蔗糖;甘氨酸;盐酸等。丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺产品不纯时需要纯化后才能使用。(1)丙烯酰胺纯化法:70g丙烯酰胺溶于500ml氯仿中(50℃),热滤,滤液凉后置-20℃冰箱,即有结晶析出,砂芯漏斗过滤,收集结晶。结晶置于真空干燥器中减压干燥,贮棕色瓶中备用。(2)甲叉双丙烯酰胺纯化法:12g甲叉双丙烯酰胺溶于100ml 40~50℃丙酮,加热过滤,滤液置-20℃冰箱,结晶析出后过滤,并置于真空干燥器中干燥,保存于棕色瓶中备用。3.试剂配制(1)凝胶及缓冲液配制系统有关资料很多,可以根据需要选择适宜的系统。列表4供参考。最常用的是系统1(所谓Davis的标准状态)。各种贮存液配制后,盛于棕色瓶中,贮冰箱备用。用时需测PH值,以检查是否失效。TEMED要密封贮藏。过硫酸铵溶液最好现用现配,不宜超过一周。表4 几种适用电泳的聚丙烯酰胺凝胶系统系统Ⅰ(PH值8.9)(7.2%)系统Ⅱ(PH值7.5)(7.5%) 系统Ⅲ(PH值4.3)(15%)系统Ⅳ(PH值2.9)(7.5%)溶液号组份/100 mlPH值溶液号组份/100mlPH值溶液号组份/100mlPH值溶液号组份/100mlPH值11mol/l HCl48.0mlTris 36.3克TEMED0.46ml8.9151mo;/L HCl48.0mlTris 6.85克TEMED0.46ml7.5171mol/L KOH48.0ml醋酸17.2 mlTEMED4.0ml4.3201mol/l KOH12.0ml醋酸.25mlTEMED1.15ml2.92a丙烯酰胺28.0克双丙烯酰胺0.735克82丙烯酰胺30.0克双丙烯酰胺0.8克68丙烯酰胺60.0克双丙烯酰胺0.4克?21过硫酸铵2.8克?3过硫酸铵0.14克?161N H3PO439.0mlTris 4.95克TEMED 0.46ml5.518过硫酸铵0.28克?221N KOH48.0升醋酸2.95ml5.94a1N HCl48mlTris 5.98克TEMED0.46ml6.7???191N KOH48.0ml醋酸2.87mlTEMED0.46ml6.7???5丙烯酰胺10.0克双丙烯酰胺2.5克6.7?????????6核黄素4.0mg??????????7蔗糖40.0克??????????电极缓冲液:Tris 6.0克甘氨酸 28.8克加水至 1升使用:10%稀释液8.3电极缓冲液:二乙基巴比妥 5.82克Tris 1.0克加水至 1升7.0电极缓冲液:β-丙氨酸 32.2克醋酸 8.0克加水至1升使用:10%稀释液4.5电极缓冲液:甘氨酸 28.1克醋酸 3.06ml加水至1升使用:10%稀释液4.0电极:上槽接负极Θ 下槽接正极⊕电极:上槽接负极Θ 下槽接正极⊕电极:上槽接正极⊕ 下槽接负极Θ电极:上槽接正极⊕ 下槽接负极Θ各溶液混合比各溶液混合比各溶液混合比各溶液混合比浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶浓缩胶分离胶1份4a号2份5号1份6号4份7号1份1号2份2a号1份水4份3号1份16号2份5号1份6号4份7号1份15号 2份2号1份水4份3号1份19号2份5号1份6号4份7号1份17号2份8号1份水4份18号1份22号2份5号1份6号4份7号4份20号2份2号2份21号(2)指示剂配制蛋白质样品通常是无色的,为了观察和估计样品在凝胶上迁移情况,常加指示剂作为电泳迁移的可见标志。对碱性缓冲系统,一般用溴酚蓝或酚红,对于酸性缓冲系统,一般用甲基绿或次甲基兰。指示剂可直接加在样品中,也可加在电泳槽的缓冲液中,也可加在玻管中。溴酚蓝通常配制成0.1%的母液备用。(3)染色剂配制蛋白质的染色方法很多,常用的染色剂有氨基黑10B,考马斯亮蓝R250,考马斯亮蓝G250等,有关配制浓度,染色方法以及同工酶的显色方法见操作过程中的染色部分。4.操作技术(1)凝胶制备配制凝胶前,应把玻璃管装好。装玻管的方式很多:在凝胶架的孔洞内,加少许40%蔗糖溶液,然后把洗净干燥的玻璃管套上乳胶管,插入架的孔洞内,使玻璃管、乳胶管与孔底相平;玻璃管的一端用青霉素瓶盖封口,或者用附有玻璃短柱的乳胶管封口;底平坦的玻管也可用橡皮膏布封口,封口的玻管安放在试管架上;也可把玻璃管用橡皮筋捆扎在一起,一端搞平后放在培养皿中,然后用1%琼脂趁热倒在培养皿中,冷却后,玻璃管口即被琼脂凝胶封住。配制凝胶时,先将所需的贮备液自冰箱中取出,放至室温下预温。聚丙烯酰胺凝胶通常只制备二种胶。先制备分离胶,再在分离胶上面制备浓缩胶,样品胶一般不制作,这是因为①有些样品会抑制胶聚合;②光照可引起某些蛋白质变性;③多了一道手续,延长制胶时间。分离胶的制备:按表4比例混合贮存液,(先不与过硫酸铵混合),放在真空干燥器中抽气,排除溶液中空气。抽气后在贮存液中加入过硫酸铵混匀,用注射器沿玻璃管壁慢慢注入胶液,各支玻管注入的量要相同,或按事先作好标记,注胶到相同的高度。务必勿使气泡出现。为了使凝胶表面平整,在凝胶表面再慢慢地加入一层水,约3~5mm高度,消除凝胶的弯月面。加水要小心,切勿冲乱界面。加水的另一作用是隔绝空气中氧与胶液接触。以防影响顶部胶层的聚合。注射器中残留的胶液要立即清洗掉,以防胶液在针头与注射器中聚合,而使其损坏。水层放好后,静置30分钟,使凝胶进行化学聚合反应。聚合最适温度为25℃。当水刚加入胶面时,水与凝胶形成一界面,后界面慢慢消失,当凝胶聚合时,水与凝胶之间又出现界面。界面的再出现表明凝胶已经聚合,再静置20~30分钟,聚合便完全。分离胶的预电泳(此步骤应根据实验的需要决定取舍):凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质,尤其是过硫酸铵,对某些样品(如酶)会造成钝化或引起其它人为效应。因此有时需要在正式电泳前,先用电泳方法除去这些残留物,称为“预电泳”。若直接用光密度计来扫描分离的区带,则预电泳更为重要,因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收,会干扰测定。步骤:去除玻管封口,倒出玻管中凝胶上的水分,并用分离胶缓冲液洗涤一下。把玻管插入电泳装置中。上下电极槽中均加入分离胶缓冲液,预电泳的电流为3mA/管,时间需30分钟~2小时。预电泳不能在制好浓缩胶后进行,也不能用电极缓冲液进行,不然会破坏不连续系统,而使浓缩效应失效。浓缩胶的制备:分离胶聚合好后,或已经过预电泳的分离胶,用注射器小心吸去水层,用滤纸条吸去残余的水。按表4中比例混合浓缩胶液(也预先抽气,抽气时不要与核黄素混合,使用时再混匀),先用这种凝胶液漂洗一下分离胶顶,除去漂洗液后,再用注射器加浓缩胶溶液1cm左右,各管加的高度应一致,并在上面加水层压平胶面。放在两只20W以上功率的日光灯下,约离灯管10~15cm处,光下聚合60分钟左右,当浓缩胶由浅黄色变为不透明的乳白色,即聚合完成,取出水层,吸干后用电极缓冲液洗涤,准备加样。浓缩胶应临用前制备。(2)样品的准备聚丙烯酰胺盘状电泳可用于分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清、唾液、细胞膜蛋白,动植物及微生物的各种蛋白提取液,昆虫的体液,各种酶制品,色素蛋白复合体以及核糖核酸等。初学者可用现成的蛋白质样品如血清练习操作。盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管按体积,需要5~100μl的样品(约0.1~2mm高);按含量需要5~100μg。实际上就是用0.1%浓度的样品5~100μl。由于样品组分的不同,用量可有一定的幅度。对于只含有少数组分的样品,通常用10~20μg,对于含有多种组分的样品,可用到200μg。即每一凝胶的样品容纳量不仅指所加的样品总量,更重要的是指样品混合物组分的量。所加样品液量的精确性将影响重复性,误差要不大于±5%。近来,样品胶一般已改用样品液中加入5%~20%的蔗糖或10%甘油代替,因为样品胶的作用主要是抗对流,蔗糖液和甘油能起同样的效果。如果样品离子强度太高,会引起分界面模糊不清,严重时完全不能进行电泳。因离子强度太高时降低了蛋白质的电动电位,同时电导过高,在样品部分几乎没有电势梯度,以至样品的泳动速度近于零,不能泳动。硫酸铵盐析的样品或柱层析高盐浓度的洗脱部分,必须透析除盐,务必使其电导低于分离胶的电导,以便形成足够的电势梯度,使区带在分离之前进行浓缩变窄。如果样品过稀,加样体积太大时,相应地加厚浓缩胶层。玻璃管也要适当加长。通常稀样液与浓缩胶的比不大于1∶1.2。一个生物样品(粗抽提物),常需要事先经过处理(高速离心,微孔滤膜过滤,柱分离等)去除沉淀,消除混浊。或只取可溶性部分进行电泳。不然常有许多物质留在凝胶与缓冲液的界面上,阻塞凝胶,干扰分离。当样品装载量与样品溶解度不相应时,也会在浓缩胶上或浓缩胶与分离胶界面上产生沉淀,并造成拖尾现象(随着电泳过程,沉淀逐渐溶解,逐渐进入)。加样前先把密封下口的物件除去,如果是拔橡皮帽,应先让空气进去,再拔管子,防止凝胶拉坏。下槽中放满缓冲液,把玻管固定在盘状电泳槽上槽的洞中。安装时要特别注意保证凝胶管垂直和橡胶塞孔密封不漏。管的下端悬一滴电极缓冲液。先在下槽放上电极缓冲液,再把上槽放在下槽上,避免管下有气泡。然后加样。加样方法因人习惯不同而略有差异。有的把样品与增加比重的蔗糖及指示剂先混在一起加样;有的指示剂单独加在玻璃管中或在上槽电极缓冲液中滴上几滴指示剂。加样时,有的先加好样液,再在样品上加几滴缓冲液,然后在样液上加电极槽缓冲液;有的先在上槽中加满电极缓冲液,然后用加样器插在缓冲液中往胶管浓缩胶上方加样。总的原则,先提高样品的比重,后加样,加样和加电极缓冲液互不干扰。(3)电泳在电泳槽中注满电极缓冲液。缓冲液应事先在冰箱中预冷,上槽电极缓冲液必须浸没玻管和电极。连接直流稳压电源,缓冲液系统为碱性时上槽为负极,下槽为正极。缓冲系统为酸性时则相反。Davis标准状态的凝胶电泳,负极在上,正极在下,电泳槽一般放在冰箱中,保持温度在0~4℃。打开电源开关,调节电流,开始时用1~2mA/管,电泳3~5分钟后,再逐渐升高到4mA/管。不要一开始就电流很高。电流最好不要超过5mA/管。太高的电流强度会造成产热量大,使分离失败。如果高温对样品不利,可降低电流,延长时间,或进行有效冷却,在整个电泳过程中,一般要求电流保持稳定。电泳时间与所用缓冲液和样品有关,一般根据指示剂的迁移来决定,如果指示剂已迁移到凝胶柱的下口附近,或已迁移管长的3/4距离时,就可停止电泳,关闭电源,取出玻璃管。上槽电极缓冲液可连续使用几次,但必须每次测一下PH,如PH值发生改变就不能再使用。每次电泳后,下槽中混入了催化剂及氯离子,如将下槽缓冲液用于上槽,则影响电泳。重要的电泳,电极缓冲液最好用新鲜的。(4)剥胶为了防止电泳后凝胶中蛋白(酶)盘状区带扩散,电泳完毕必须立刻取出凝胶柱进行固定与染色,一般用20~30ml的注射器配上10cm长的针头,左手拿玻管,右手握灌满水的注射器,将针头插入凝胶与管壁之间,左手慢慢旋转玻管,右手一边压水,一边使针头呈螺旋式推进。靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开,一般情况下,针头抽出,胶就自动滑出。如果不出,就从另一端再注水或用洗耳球在一端稍加压力。如果胶浓度较高,取出困难,可用10%甘油水溶液代替水注入。一般剥胶的方向是从浓缩胶端开始。剥胶时应注意不要损伤胶柱表面。(5)固定与染色为防止凝胶柱内已分离成分的扩散,需要进行固定。剥出的凝胶柱只要浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟就可达到蛋白带固定的效果。也可浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中,同时进行固定和染色。如果用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和鉴定同工酶,为了让酶带上进行某种显色反应,往往是先显色后固定。三氯醋酸固定蛋白质的机制可能是这样:其分子不仅与蛋白质带正电荷侧链结合,而且通过氢键与蛋白质的肽链结合,其结果使蛋白质分子失去水分子,同时在肽链表面包上一层疏水的CCl3基团,使蛋白质水溶性破坏,从水相沉淀在凝胶相上。乙酸固定蛋白质的机制可能同三氯乙酸一样。电泳后蛋白质区带的检测,对于不同的目的,应采用不同的检测方法,最常用的方法是用染料和生物大分子结合形成有色的复合物,选用染料通常应考虑以下要求:A)必须与大分子结合以形成一个不溶性的,有色的,紧密的复合物,但不结合到凝胶中和支持膜上,以便从凝胶中除去,否则背景会影响蛋白带的辨别和定量扫描;B)染料必须容易溶解在对大分子没有影响的溶剂中,以利于背景的脱色;C)选用高吸光系数的染料有利于提高定量测定的灵敏度;D)选用能与大分子有专一性结合的染料,并在结合后能产生不同的颜色,可以提高检测的选择性。用于蛋白质区带染色的试剂常用的有氨基黑10B、考马斯亮蓝,1-苯胺基-8-萘磺酸等,其性能及染色原理如下:①氨基黑10B (amino black 10B) C22H13O12N6S3Na3 MW=715 λmax=620~630nm 氨基黑是酸性染料,其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染SDS-蛋白质时效果不好。另外氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等,色调不一(有蓝、黑、棕等),作同一凝胶柱的扫描时误差较大,需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质-染料量(吸收值)的标准曲线(Coomassie brilliant blne R250) 即三苯基甲烷(triphenylmethane) C46H44O7H3S2Na MW=824 λmax=560~590nm 染色的灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色,但蛋白质浓度超出一定范围时,对高浓度蛋白的染色不合乎Beer定律,用作定量分析时要注意这点。③考马斯亮兰G250(Coomassie brilliant blne G250),即二甲花青亮蓝(Xylene Cyanine brilliant Blue),MW=854,λmax=590~610nm,染色灵敏度不如R250,但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体,能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色,适于作定量分析。氨基黑与考马斯亮兰两种染料的共同点是:都带有负电荷的磺酸基,能与蛋白分子上带正电荷的侧链相结合。但是,氨基黑分子含有较多的亲水基团,和蛋白质亲水微区以及亲水的凝胶基质有很大的亲和力。而考马斯亮兰却相反,含有较多的疏水基团,和蛋白质的疏水区有较大的亲和力,而和凝胶基质的亲和力不如氨基黑。因此,用考马斯亮兰染色的漂洗要容易得多。另外,考马斯亮兰的灵敏度要比氨基黑高。4.1-苯胺基-8-萘磺酸(1-animo-naphthal sulfonic acid简称ANS),MW=241,本身无荧光,但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后,凝胶在此染料溶液浸1~3分钟,用长波紫外灯照射时产生黄色荧光,可显示蛋白质100mg,如果不明显,可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中,或浸没在3mol/L盐酸中几秒至2分钟,使表面蛋白质稍变性,然后再用表5 蛋白质的常染色法方 法固 定 液染 料染色时间脱 色氨基黑10B甲 醇7%乙酸0.1N氢氧化钠中1%氨基黑7%乙酸中0.5%~1%氨基黑5分钟(室温)2小时(室温)10分钟(96℃)5%乙醇7%乙酸考马斯亮兰 R25020%磺基水杨酸10%三氯乙酸样品中含尿素的在5%三氯乙酸中固定0.25%R250水溶液10%三氯乙酸-1%R25019∶1(V/V)5%磺基水杨酸和1%R25019∶15分钟(室温)0.5小时(室温)1小时(室温)7%乙酸10%三氯乙酸90%甲酸考马斯亮兰 G2506%乙酸12.5%三氯乙酸6%乙酸中1% G25012.5%三氯乙酸中0.1% G25010分钟(室温)30分钟(室温)甲醇-水-浓氨64∶36∶11-苯胺基-8-萘磺酸2mol/L盐酸浸几秒种PH6.8,0.1mol/L磷酸盐缓冲液中0.003%染料3分钟?Ponceau 3R12.5%三氯乙酸0.1mol/L NaOH中1%3R2分钟(室温)5%乙醇固绿7%乙酸7%乙酸中1%固绿2小时(5℃)7%乙酸ANS染色,这样可显示蛋白质20μg。这种染色优点是可保留凝胶内中的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定,也可直接把凝胶捣碎研细,用作抗原来注射动物,聚丙烯酰胺不影响抗体的产生。常用染色方法见表5。(6)脱色凝胶柱染色后,先用水洗掉表面染料,然后放在脱色液中浸洗,常用的脱色液有7%乙酸,甲醇-水-乙酸溶液等。经常更换新溶液,直到染料洗出,背景几乎无色为止。用氨基黑染色的,脱色时间较长,而考马斯亮蓝染料易于脱色。为了短时间得出结果,可采用电泳脱色。即在一玻璃或有机玻璃槽中盛7%的乙酸溶液,已染色的胶放置在槽中间,两边加铂金电极,并通直流电,电压30~40V,电流0.5A左右,1~2小时即可脱色完毕。(7)结果的记录记录电泳结果常用的方法有①绘制示意图,将各个样品的酶带如实地描绘下来,根据酶带宽窄,颜色深浅,拟分七级表示之(图10)。一级宽带 酶带色深而宽二级宽带 酶带色浅而宽 三级宽带 酶带色极浅而宽 一级宽带 酶带色深而宽二级宽带 酶带色浅而宽 三级宽带 酶带色极浅而宽 一级窄带 酶带色深而窄二级窄带 酶带色浅而窄三级窄带 酶带色极浅而窄 扩散带 酶带扩散?????????图10 酶带的分级标准?②测量相对迁移率(Rf):分离区带的泳动速度可用相对迁移率来表示。测定迁移率时,在电泳结束后要先在指示剂移动的位置(前沿)作一标记(通常是插一根短铜丝),染色后,量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。Rf= 酶带迁移距离/ 前沿指示剂迁移距离 测量迁移率时,应以酶带的中部位置为准,值得注意的是,交联剂的浓度,交联剂和丙烯酰胺的比例,催化剂浓度及聚胶时的温度和时间均对凝胶柱结构有影响,因而会影响迁移率。另外,电泳时电场强度等也会影响带电颗粒迁移速度。为了使试验重复性好,这些因子都应尽可能保持恒定。③照相:采用透射照相方法,用照相机把酶带真实地拍摄下来,盘状电泳的凝胶柱一般放在试管中(注满脱色液或保存液)拍摄。对于绿色、蓝色和暗蓝色的染色区带,照相时可加黄滤色镜,能增加清晰度。④光密度计扫描定量:把酶带放在光密度扫描仪上,描绘酶谱——光密度曲线。配合计算机,可作定量分析。(二)垂直平板电泳垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳和管型盘状凝胶电泳相比,具有以下优点:①一系列样品可以在相同的制板、电泳、显色条件下进行比较,减少试验误差;②在一块平板上点样数目可根据需要任意变动,可多可少;③凝胶可制成干板,作为科研资料长期保存;④电泳后取胶、显色、摄影等都较方便,并能得到较好的效果。由于具有上述优点,故近年来垂直平板凝胶电泳技术发展较快,现将方法介绍如下:垂直平板凝胶电泳所用的电泳仪,配制分离胶、浓缩胶的试剂,以及固定染色、脱色用的药品可与盘状凝胶电泳通用,所不同的主要在电泳槽结构上,以及随之带来的操作方法上。1.器材 夹心式垂直板电泳槽,凝胶模(135×100×1.5mm)(北京六一仪器厂),直流稳压电源(电压300~600V,电流50~100mA),吸量管(1,5,10mL),烧杯(25,50,100mL),细长头的滴管,1mL注射器及6号长针头,微量注射器(10μL或50μL),水泵或油泵,真空干燥器,培养皿(直径120mm),玻璃板(13×13cm),玻璃纸2张(18×18cm),日光灯一台。2.操作方法? ????????图11 夹心垂直平板电泳槽示意图??????????图12 凝胶模示意图3.操作技术(1)安装夹心式垂直板电泳槽 夹心式垂直板电泳槽(图11)两侧为有机玻璃制成的电极槽,两电极槽中间有一凝胶模(图12),该模由ㄩ形硅胶框,长、短玻璃板,模板梳组成,电泳槽由上贮槽(白金电极面对短玻璃板),下贮槽(白金电极面对长玻璃板)和回纹冷凝管组成,两电极槽与凝胶模间靠贮液槽螺丝固定,其组装顺序为:①装贮槽和固定螺丝销钉;②将洗净的长、短玻璃板分别插到ㄩ形硅橡胶框的凹形槽中,注意不要用手接触灌胶面的玻璃;③将已插好玻板的凝胶模夹到贮槽中,短玻璃板应面对上贮槽,长玻璃板应面对下贮槽,双手以对角线的方式旋紧螺丝帽;④竖直电泳槽,用滴管吸取少量的1%琼脂糖溶液,灌入凝胶模板底部(长玻璃板外侧,下沿凹形小槽内),液面高度约0.5~1.0cm,待琼脂糖凝固后,即堵住凝胶模下面的窄缝(通电时又可作为盐桥)。(2)制备凝胶板①分离胶制备:配制分离胶溶液(见表4),将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm),用注射器在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气,并使胶面平整。为防止渗漏,在上下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30~60分钟凝胶完全聚合后,可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限,用滤纸吸去多余的水。②浓缩胶制备:配制浓缩胶溶液(见表4),用滴管将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方),轻轻加入样品模板梳,用日光灯照射进行光聚合,约30分钟后,凝胶由淡黄透明变成乳白色,聚合完全后,轻轻取出样品模板梳,加入电极缓冲液,使液面没过短玻璃板约0.5cm。(3)加样 用微量注射器取样品溶液5~10μl,小心地加入到凝胶凹形样品槽底部,因样品比重大于电极缓冲液,因此样品液自动沉降在胶面上平铺成一层。(4)电泳 加样毕,在上槽加入0.1%溴酚蓝数滴,不要移动电泳槽(防引起样品漂流),接通电源,先低压电泳一般时间,待指示剂在胶板上成一条直线时,即可将电泳槽移入冰箱,按所需电流电压进行电泳。温度控制在0~4℃。由于电流和电压同电极缓冲液的离子强度有关,因此根据电极缓冲液分高离子强度和低离子强度两种。高离子强度电极缓冲液配方:141.1g甘氨酸加30g Tris加水1000ml,用时稀释20倍调PH值至8.3;低离子强度电极缓冲液配方:2g甘氨酸加5.2g Tris加水至1000ml,用时衡释10倍,调PH值至8.7。当电极缓冲液离子强度确定后,又有稳定电流和稳定电压两种电泳方式。用高离子强度电泳液,稳定电流2.0~2.5mA/cm,电泳16小时左右;用低离子强度电泳液,稳定电流0.2~0.3mA/cm,电泳16小时左右,此为稳定电流的方法。稳定电压电泳方式通常是这样:用高离子强度时,稳定电压10V/cm,电泳14~15小时;用低离子强度时,稳定电压20V/cm,约4~5小时。若指示剂移动到离下层电泳液水平面1cm处,即可关闭电源,停止电泳。(5)卸板 电泳完毕,从冰箱中取出电泳槽,吸出电极缓冲液,将胶板从电泳槽上卸下,平放在实验台上,用压舌板在两块玻璃板的一角轻轻一撬,揭去上面长型玻璃板。用刀片在胶板一端切除一角作为标记,而后用磨平针尖的兽医用针头吸取无离子水把凝胶从短型玻璃板上剥离,慢慢地把胶板冲入白瓷盘或大培养皿内,即可染色与固定。(6)固定、染色和脱色 与垂直管型盘状电泳所用的方法相同。(7)结果和记录 除按管型盘状电泳法记录实验结果外,还可以制成干板保存。在水中用两张比胶板稍大的玻璃纸,将胶板夹在中间,平放在玻璃板上,排除气泡,四周用玻璃条压住并用夹子固定在玻璃板上,30℃烘干或自然风干。包前如将胶板放在10%的甘油中浸泡片刻,则效果会更好。?五、聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术等电聚焦(isoelectric focusing),缩写为IEF或EF,也称等电分离、等电点划分,等电点分析、聚焦电泳等,是六十年代后期才发展起来的新技术,它不仅用来分离、鉴定和测定蛋白质等电点,分离复合蛋白,同时还可以结合SDS电泳,密度梯度和一般凝胶电泳进行双向电泳来分析蛋白质的亚基,分子大小和各种蛋白质成分的图谱,因此,它已成为电泳中不可缺少的技术。(一)原理等电点聚焦就是在电泳槽中放入两性电解质载体,通以直流电时,两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的PH梯度,当蛋白质放进此体系时,不同蛋白质即移动到或聚焦于与其相当的等电点PH位置上。其原理可用图13表示。图13 等电聚焦原理图13 等电聚焦原理????????????电泳槽中放入两性电解质载体和蛋白质样品1、2、3其等电点分别为PI1、PI2、PI3。两性电解质在阳极的两性介质中会得到质子而带正电,在阴极碱性介质中则失去质子而带负电,这样就会受电场力的作用各自向相反方向移动。如果有很多的两性电解质,它们就会按照等电点由低到高的顺序在电泳槽中依次排列。于是形成一个由阴极到阳极连续增加的PH梯度。蛋白质也是一种两性分子,在电场中按其表面所带电荷进行移动。A开始带正电,它就向负极高PH区域移动,分子的负电荷逐步增加,即通过羧基和氨基的去极化,最后达到净电荷为零。反之,C种蛋白质分子表面电荷是带负电荷,它就向PH低的区域移动,当分子净电荷达到零时也停止运动。这样根据蛋白质所带电荷不同就可以进行分离。净电荷为零的区域就是该蛋白质的等电点(PI)。因此,根据PH梯度和泳动的距离就可以测出蛋白质的等电点。目前常用的载体两性电解质商品有ampholine(LKB公司)、Pharmlyte(Pharmacia)、Serralyte(Serva)以及国产的Ampholine(上海生化所东风厂生产)。Ampholine(图14)是具有多等电点的多氨基多羧基酸类化合物,其主要理化性质为:①缓冲性能强 Ampholine溶液在一定PH范围内有充分的缓冲能力,当蛋白质进入与其等电点相应的PH区域时,PH值并无变化;②导电性能好 Ampholine溶液有均衡的电场强度,但是在PH等于中性的区域导电性能较差。因此在应用时,不管选择什么PH范围,一般都要加入其总量1/10的PH6~8的Ampholine溶液,以保持电场强度的均匀性;③分子量小 Ampholine一般分子量都在300~1000之间。一便用分子筛或透析等方法将它与被分离的高分子物质分开;④紫外吸收值低 Ampholine对于在280nm处测定蛋白质吸收值的干扰小,但是如果蛋白质浓度低,Ampholine用量又高,则往往干扰较明显,严重时应进行矫正;⑤一般与样品不起化学反应。图14 瑞典LKB公司Ampholine的结构式PH范围等电聚焦的优点是:①有很高的分辨率,可将等电点相差0.01~0.02PH单位的蛋白质分开;②一般电泳由于受扩散作用的影响,随着时间和所走距离加长,区带越走越宽,而电聚焦能抵消扩散作用,使区带越走越窄;③由于这种电聚焦作用,不管样品加在什么部位,都可聚焦到其等电点处,很稀的样品也可进行分离;④可直接测出蛋白质的等电点,其精确度可达0.01PH单位。等电聚焦电泳也有缺点,一是电聚焦要求用无盐溶液,而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀,二是样品中的成分必需停留于其等电点,不适用于在等电点时发生沉淀或变性的蛋白质。电聚焦技术要求有稳定的PH梯度,要求有防止对流和防止已分离区带再混合的措施,其办法有三:密度梯度等电聚焦,聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦和区带对流等电聚焦,本文仅介绍以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的等电聚焦的技术。聚丙烯胺凝胶等电聚焦电泳其原理已与普通聚丙烯酰胺凝胶电泳不同,它不利用凝胶的分子筛作用。(二)操作方法1.仪器与设备同一般盘状电泳和平板电泳。2.试剂丙烯酰胺;甲叉双丙烯酰胺;四甲基乙二胺,过硫酸铵、蔗糖、两性电解质载体Ampholine PH4~10,20%(上海生化所东风厂生产,瑞典LKB产品有40%的)等。表6 等电聚焦板状凝胶液的组成(ml)试 剂胶的PH值5.5~9.52.5~65~8.57.5~10.5丙烯酰胺30%甲叉双丙烯酰胺1.2%(W/V黄素4mg/100ml水0.40.40.4?过硫酸铵2%???0.4四甲基乙二胺1%3333蔗糖25%(W/V)303030?山梨醇25%(W/V)???30两性电解质40%????PH值 3.5~102.3???2.5~101.2???4~60.21.2??5~70.20.61.5?7~9??1.50.29~100.4??3.6水和样品总体积1313.613.612.83.胶的制备圆柱状胶:总体积30ml中内含丙烯酰胺5.7ml,蔗糖15ml,四甲基乙二胺0.45ml,水5ml,20%两性载体电解质3ml,过硫酸铵1.25ml。此凝胶浓度(T) =7.2%,交联度(C) =2.1%,蔗糖浓度为12.5%,两性载体电解质含2%。如果蛋白质样品比较稀,可以放在胶的混合液中一起聚合,这时应扣除蛋白样品体积,即蛋白质样品溶液可看作为水体积。板状胶:若采用平板电泳,则需制备板状胶,其组成参考表6。其中T=5%,C=4%。制胶的方法与一般凝胶电泳相同;用核黄素作催化剂的是光聚合,用过硫酸铵作催化剂的是化学聚合。4.加样根据等电聚集原理,每个蛋白质都浓缩在它的PI位置,所以聚焦时样品不需要加成窄带,而且可以加在凝胶表面的任何一个位置,如图15样品被加在胶的中间或被加在整个胶都可得到相同的结果。 处次实验时,可用不同浓度的样品且放在不同位置来摸索,以确定合适的浓度和位置。如果样品较浓,且易失活,通常把样品加在凝胶的顶部。为了不使样品接触电极溶液,在加内含10%蔗糖的10~50μg样品后,再将胶管顶部另加1%两性电解质。样品也可以在凝胶经预电泳后加入,但要注意PH值对蛋白质样品的影响程度。如果样品对高PH值敏感的话,一般在电泳前加入。因为在电泳前,负极端的PH值接近介质PH值,电泳进行后,在很短时间内S型的PH值梯度就形成,这时负极端的PH值较高。图15 加样方式? 图15 加样方式5.电泳常用的负电极槽溶液有乙醇胺,三乙醇胺或氢氧化钠;正极槽溶液用磷酸、硫酸。一般负极槽溶液用2%的三乙醇胺,正极槽溶液用1.7%磷酸。上槽为负极,下槽为正极。起始电流每胶管1mA,半小时后,电压逐步升高,电流下降,待电压上升到370V左右不再上升,电流下降到小于2mA左右时,再继续电泳1小时。从开始到泳动完毕约为6小时。起始电流大,PH值梯度形成快,聚胶时间短,但易局部发热,聚焦后蛋白带不齐,胶发生断裂等现象。一般在10℃以下进行,起始电流控制在每胶管0.1~1mA。板状胶等电聚焦的电极槽溶液列于表7。对于25×10×2cm的胶板,平均功率10W,即50V/cm,聚焦4~6小时。表7 板状胶等电聚焦的电极槽溶液PH值范围负 极正 极3.5~9.51mol/L NaOH1mol/L H3PO42.5~60.5%两性解质PH5~71mol/L H3PO45~3.50.1~1mol/L NaOH或1%两性电解质PH值5~100.1~0mol/l H3P04或1%两性电解质PH5~97.5~10.51mol/L NaOH0.1%两性电解质PH7~96.染色蛋白质染色:电泳完毕后,将胶柱或胶板取出放入12.5%三氯乙酸(TCA)溶液里过夜。并更换两次,然后进行蛋白染色。表8 常 用 的 染 色 方 法染 料12.5%三氯乙酸浸泡次数染料浓度%(W/V)甲醇∶水∶冰醋酸去色时间(小时)灵敏度(μg)染色液去色液氨基黑10B30.250∶50∶1066∶33∶1010~205~10考马斯亮蓝 G25030.250∶50∶1033∶66∶103~50.5~1考马斯亮蓝 R25030.250∶50∶1033∶66∶103~50.5~1考马斯亮蓝 R1500或10.250∶50∶1033∶66∶102~32亮 绿0或10.233∶66∶1033∶66∶1013?常用染色方法见表8。对于一般蛋白质来说用考马斯亮蓝G-250过氯酸溶液染色较好,显色较快,不需要脱色就可以看出清晰的蛋白带。7.PH梯度的测定用1mm宽的广谱PH试纸条,贴到一条没加蛋白质样品的胶上,用水湿润PH试纸,定性观察PH梯度。将另外两个没有加蛋白质的胶条,切成5mm长的小段,加入去离子水3ml浸1~2小时,用精密PH计测定其PH值。以距阳极端的距离为横座标,以其对应的PH为纵座标作PH梯度曲线.等电点测定将欲测样品同时做4根胶柱。其中两根胶柱作为蛋白或酶谱显色,以决定蛋白带和酶带的位置。另两根胶柱切成5mm切段,将相对应的切段按顺序浸入4ml去离子水中(用前煮沸,除去CO2,以免影响PH值),加盖,置冰箱中过夜,第二天用PH计测各切段溶液的PH。将PH值与胶的长度作PH梯度图。相应蛋白带或酶带位置的PH值就是等电点。9.扫描脱色后的胶柱可用光密度计扫描。?六、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术聚丙烯酰胺凝胶分为原性凝胶和变性凝胶两种。所谓原性凝胶,即在凝胶中不加变性剂,这种凝胶中,蛋白质的迁移率受它的静电荷与分子大小两个因素的影响。分子量不同,而带静电荷相同,可有相同的迁移率。因此在原性凝胶中进行电泳是不能测得分子量的。所谓变性凝胶,即在凝胶中加入变性剂,如尿素、SDS(十二烷基磺酸钠)、巯基乙醇苏二硫、糖醇等。这些变性剂可以破坏或改变蛋白质的结构,把绝大部分蛋白质分离成组成它们的亚基。同时在蛋白质分子周围包围了大量负电荷。这种电荷基本上掩盖了无变性剂存在时正常就有的任何电荷。蛋白质在这种变性凝胶中的迁移率与它们分子量的对数成直线关系。因此利用变性凝胶进行电泳可以测得蛋白质的分子量。目前应用较多的变性剂为SDS。本节介绍SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理与方法。(一)原理SDS(sodium dodecyl sulfate),H25C12NaSO4 M=288.38g/mol,是一种很强的阴离子表面活性剂。SDS能破坏蛋白质分子间的结构(尤其是在强还原剂如巯基乙醇存在下,使蛋白质分子内的二硫键还原打开),并以其疏水基和蛋白质分子的疏水区相结合,形成牢固的带负电荷的蛋白质-SDS复合物。在一定条件下,SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质。所引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电荷的10倍,使得其所带电荷远超过蛋白质原有的净电荷,从而清除或大大降低了不同蛋白质之间所带的净电荷不同对电泳迁移率的影响。SDS与蛋白质结合后,还引起了蛋白质构象的改变,由蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明,它们在水溶液中的形状,近似于雪茄烟形的长椭圆棒(图16),不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样,约为10A,而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。这样的蛋白质-SDS复合物,在凝胶电泳中迁移率,不再受蛋白质原有电荷和形状的影响,迁移率只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数,可用下式表示。M=K(-10-bm)1gM=1gK-bm=K1-bmM为蛋白质的分子量;K、K1为常数,b为斜率,m为迁移率。上式也称Ferguson方程。测定时,通常选用已知分子量的标准蛋白质作为“标记物”(maker),与分子量未知的待测蛋白质样品在同一条件下进行SDS-聚丙烯酰胺凝焦电泳,将已知分子量的标准蛋白质的相对迁移率,在半对数坐标纸上与分子量的对数作图,可得到一条lgMW-mR的标准曲线),从标准曲线上找出待测蛋白质样品的mR所对应的lgMW,即可求得分子量。现在经SDS-凝胶电泳研究过的蛋白质已有一百多种。由于用这一方法测定蛋白质分子量具有分辨率高,重复性好,设备简单,操作简便、快速等优点,已发展成为蛋白质研究的有力工具。在分子量为15000~20000的范围内,与用其他方法测得的分子量相比,误差一般在±10%以内。但用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时,应注意以下几个问题:1.如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4g SDS/1g, 蛋白质的比率并具有相同的构象,就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素,主要有以下3个:(1)二硫键是否完全被还原;只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下,SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去,并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下,还需进一步将形成的巯基烷基化,以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。(2)溶液中SDS的浓度:溶液中SDS的总量,至少要比蛋白质的量高3倍,一般高达10倍以上。(3)溶液的离子强度:溶液的离子强度应较低,最高不能超过0.26,因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的,SDS结合到蛋白质分子上的量,仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度,在低离子强度的溶液中,SDS单体具有较高的平衡浓度。?图16 蛋白质样品在100℃用SDS和还原试剂处理3~5分钟后解聚成亚基???????????图17 37种蛋白质的分子量对数对电泳迁移率作图分子量范围为11000~70000,10%凝胶,PH7.2 SDS-磷酸盐缓冲系统?图17 37种蛋白质的分子量对数对电泳迁移率作图分子量范围为11000~70000,10%凝胶,PH7.2 SDS-磷酸盐缓冲系统???2.不同的凝胶浓度适用于不同的分子范围,Weber的实验指出,在5%的凝胶中,分子量25000~200000的蛋白质,其分子量的对数与迁移率呈直线分子量的蛋白质呈直线分子量的蛋白质呈直线%的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。以上各种浓度的凝胶,其交联度都是2.6%。可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度,并尽量选择分子量范围和与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2~0.8之间均匀分布。在凝胶电泳中,影响迁移率的因素较多,而在制胶和电泳过程中,很难每次都将各项条件控制得完全一致,因此,用SDS-凝胶电泳法测定分子量,每次测定样品必须同时做标准曲线.有许多蛋白质,是由亚基或两条以上肽链组成的,它们在SDS和巯基乙醇的作用下,解离成亚基或单条肽链。因此,对于这一类蛋白质,SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量,而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料,还必须用其他方法测定其分子量及分子中肽链的数目等,与SDS-凝胶电泳的结果相互参照。4.不是所有蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量,已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有:电荷异常或构象异常的蛋白质,带有较大辅基的蛋白质(如某些糖蛋白),以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。因此,尽管结合了正常比例的SDS,仍不能完全掩盖其原有电荷的影响。例如组蛋白F1,分子量为21000,但由于它本身带有大量正电荷,SDS-凝胶电泳测定的结果却是35000,偏差较大。对于这些蛋白,至少要用两种方法来测定分子量,互相验证。(二)操作方法1.溶液配制①制备凝胶所需的溶液溶 液 号每100ml 溶液中的组分备 注1丙烯酰胺 30g甲叉双丙烯酰胺 0.15g过滤后,贮棕色瓶4℃保存2Tris 42.39%加HCl调至pH8.8?3SDS 10g40℃时溶解,在15℃以下难溶4EDTA·2Na 8.16g搅拌微热溶解5过硫酸铵 7.5g现用现配6丙烯酰胺 30g甲叉双丙烯酰胺 1.5g去沉淀,贮棕色瓶4℃保存7Tris 15.1g加HCl调至PH6.8??市售化学纯SDS需重结晶后使用。方法:20g SDS,放入500ml烧瓶中,加约半牛角匙活性炭与300ml无水乙醇,搅拌,摇匀。烧瓶上接一个冷凝管。在水浴中加热至乙醇微沸,洄流约10分钟,热过滤,滤液冷至室温后,移至-20℃冰箱过夜。次日,收集结晶,线℃以下烘干。②蛋白质样品处理液:0.5mol/l PH6.8 Tris-HCl缓冲液6ml;SDS(纯化的)1g;巯基乙醇 0.5ml;蔗糖 20g;溴酚蓝 0.005g, 加蒸馏水稀释至50ml。③电极缓冲液:1mol/l Tris 25ml;1.9mol/L 甘氨酸 100ml;10%SDS 5ml; 0.2mol/L EDTA·2Na 5ml,加蒸馏水稀释至500ml。④染色液:考马斯亮蓝 R-250 0.25g;甲醇 45ml;冰乙酸 9ml,加蒸馏水至100ml。⑤退色液:甲醇 50ml;冰乙酸75ml,加蒸馏水至1000ml。⑥样品提取液:0.1mol/L PH 7.2磷酸缓冲液中含有0.4mol/L NaCl和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP);NaH2PO4·H2O 4g;Na2HPO4·7H2O 19.3g;NaCl 2.3g;PVP 1g,加水量100ml并调节PH为7.2。2.样品提取 将所测样品称量后放入冰浴的研钵中,加入相当于样品量0.5~1倍的样品提取液,研磨后20000转/分,0℃离心15分钟,上清液冰浴备用。3.制板根据所测样品蛋白质分子量的大小按下表比例配制分离胶与浓缩胶。类同于垂直平板聚丙烯酰凝胶的制作方法制板。分离胶的配制比例(总量30ml)溶液号码分 离 胶 的 浓 度10%12%16%18%20%12H2O34TEMED5103160.30.30.0303 0.30.03030.30.030.2518380.30.30.030.2520360.30.30.030.25?浓缩胶的配制比例(25ml)溶液号码所需溶液ml数溶液号码所需溶液ml数67H2O82.52.519.20.254TEMED50.250.060.2?4.样品处理标准蛋白样品的制备 称取已知分子量标准蛋白样品,如细胞色素C(MW:12500);胰凝乳蛋白酶原A(25000);胃蛋白酶(35000);卵清蛋白(43000);牛血清蛋白(67000);各0.5mg左右,分别放入小试管,按0.5mg蛋白质加1ml溶液的比例加入蛋白质样品处理液。充分溶解,将小试管放入沸水浴中加热2分钟,取出冷至室温。待测蛋白质样品的制备 按1∶1比例,把待测样品提取液与蛋白质样品处理液混合,如果提取液蛋白含量低时,先浓缩后再与蛋白样品处理液混合,或提高蛋白样品处理液的浓度。以下操作与标准蛋白样品的制备相同。5.点样用微量进液器或定量加液器把处理后的待测样品与不同分子量的蛋白标准样品放入凝胶板的样品孔中,并作好标记。为了防止样品扩散,点样时,就可通电,上槽接负极,下槽接正极,使电流2~3mA。6.电泳全部样品点完后,把电泳槽移入冰箱,将电流调至10mA,30分钟后加到25mA左右,待溴酚蓝前沿跑到底部约1cm,电泳完毕,取胶,并在前沿处作记号。7.染色与脱色将凝胶放入染色液中,室温下染色1小时,然后放入退色液中浸泡,数小时换一次退色液,直至背景清晰,约需1昼夜。8.分子量计算用直尺分别量出样品区带中心,前沿与分离胶顶端的距离,分别计算待测样品与标准样品的相对迁移率,然后以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率作图,得到的标准曲线,根据待测样品的相对迁

  请自觉遵守互联网相关的政策法规,严禁发布色情、暴力、反动的言论。用户名:验证码:匿名?发表评论

北京快3平台-官网在线

联系人:李经理 座机:400-0573147 地址:河南省濮阳市巩义市夹津口工业园
微信二维码