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北京快3聚丙烯酰胺凝胶 配制方法

发布时间 2021-01-24 05:22

  5× TBE(组份浓度:5× TBE,pH 8.3;配制量:1 L):称取 53.9 g Tris,27.5 g 硼酸,量取 20 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0),置于 1 L 烧杯中;加入约 800 ml 超纯水,充分搅拌溶解;加超纯水将溶液定容至 1 L;室温保存。 10% 过硫酸铵(组份浓度:10% (W/V) 过硫酸铵;配制量:10 ml) :称取 1 g 过硫酸铵,置于 10~50 ml 烧杯中;加入约 8 ml 超纯水,搅拌溶解;加超纯水 将溶液定容至 10 ml;4 ℃保存(保存时间为 2 周左右,超过期限过硫酸铵将失 去催化作用)。 30% 丙烯酰胺(组份浓度:30% (W/V)丙烯酰胺;配制量:1 L) :称取 290 g 丙烯酰胺,10 g N,N-亚甲基双丙烯酰胺,置于 1 L 烧杯中;加入约 600 ml 超 纯水,水浴加热至 37 ℃,充分搅拌至溶解;加超纯水将溶液定容至 1 L,用 0.45 μm 滤膜过滤除去杂质;并检测该溶液 pH 值应不大于 7;棕色瓶 4 ℃保存。 0.1% AgNO( 0.1% (W/V) AgNO3; 配制量: 1 L) : 称取 1 g AgNO3, 3 组份浓度: 置于 1 L 烧杯中;加入约 800 ml 超纯水, ;加超纯水将溶液定容至 1 L;棕色 瓶室温保存。 显色液 (组份浓度: 2% (W/V) NaOH, 0.04% (W/V) Na2CO3, 0.4% (W/V) 37% 甲醛;配制量:1 L):称取 20 g NaOH,0.4 g Na2CO3,置于 1 L 烧杯中;加入 约 800 ml 超纯水,充分搅拌溶解;加 4 ml 37%甲醛溶液,加超纯水将溶液定容 至 1 L;室温保存。 10% 冰乙酸(组份浓度:10% 冰乙酸;配制量:1 L):量取 100 ml 冰乙 酸,置于 1 L 烧杯中;加入约 800 ml 超纯水,搅拌混匀;加超纯水将溶液定容 至 1 L;室温保存。 2.2.6 电泳检测 2.2.6.1 玻璃板清洗 首先用去污粉将电泳用玻璃板、胶垫、梳子等反复清洗;然后用Ⅲ级蒸馏水 漂洗 2~3 次,直至玻璃板表面出现均匀水膜,既不聚成水滴,也不成股流下; 再用超纯水漂洗 1 次,晾干;最后用无水乙醇擦拭,晾干备用[74]。 2.2.6.2 缓冲液贮液和凝胶母液的制备 缓冲液贮液用 5× TBE,具体配制方法见 2.1.2.2,用时稀释 5 倍。凝胶母液 用 30%丙烯酰胺,具体配制方法见 2.1.2.2。 2.2.6.3 聚丙烯酰胺凝胶的制备 10% 非变性聚丙烯酰胺凝胶(两块,约 55 ml)各组分用量如下[58]: 30% 丙烯酰胺:18 ml 5×TBE:11 ml 超纯水:25 ml TEMED:36 ?l 10% 过硫酸铵:385 ?l 具体操作步骤如下[75]: 首先,按要求组装好垂直电泳板,两块玻璃板的底部用 1.5% 琼脂糖封边, 防止封闭不严而导致聚丙烯酰胺胶液漏出。 然后,灌胶。分别量取配比用量的 30% 丙烯酰胺、5×TBE 和超纯水置于 100 ml 烧杯中,用玻璃棒搅拌混匀;然后用微量加样器加入配比用量的 10% 过 硫酸铵和 TEMED,加入后聚合即开始,迅速摇匀;立即用玻璃棒引流,将混合 液灌注于两块玻璃板之间,灌胶过程一次性完成,避免产生气泡;灌胶完成后, 一次性平稳插入样梳以形成点样孔。 最后,待聚合完全后往电泳槽中加入 1× TBE 缓冲液直至没过点样孔,且正 负极槽内缓冲液高度应一致。聚合时间一般在 30~60 min 左右,凝胶聚合完全 的标志是点样孔附近形成清晰的界面,轻轻拔去样梳,避免破坏点样孔,并立即 用电泳缓冲液冲洗点样孔,以清除点样孔中的气泡和未凝固完全的胶液。 2.2.6.4 电泳 取 PCR 扩增产物 5 ?l 与 1 ?l 上样缓冲液混合均匀后点入点样孔, 用 10% 非 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,以 20 bp DNA ladder(Takara)作为分子量标准, 缓冲液为 1× TBE。接通电源,恒压 180~200 V,电泳 8~10 h,直至溴酚蓝距离 凝胶边缘约 1 cm 时,停止电泳。 2.2.6.5 银染、显色 具体步骤如下[76-78]: (1)卸下玻璃板,用塑料薄片撬去上面一块玻璃板,并小心除去下方的琼 脂糖凝胶; 然后将附有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃板以凝胶面朝下浸入盛有约 200 ml 超纯水的玻璃器皿中,凝胶即脱落于水中,轻轻摇晃 15 sec,倒掉液体; (2)加入约 200 ml 0.1% AgNO3,置于摇床之上,以轻摇 20 min 左右,倒 掉液体; (3)加入约 200 ml 超纯水,轻摇 15 sec,倒掉液体; (4)加入约 200 ml 显色液,轻摇 5~10 min,直至出现清晰带型,倒掉液 体; (5)加入约 200 ml 超纯水,轻摇 15 sec,倒掉液体; (6)加入约 200 ml 10% 冰乙酸,固定; (7)用 Bio-Rad 紫外凝胶成像系统观察,照相以记录电泳结果。 1.4.3 聚丙烯酰胺凝胶改进的银染方法 (1) 电泳结束后切断电源 , 从电泳槽中倒出缓冲液, 然后取下胶板, 将凝胶从玻 板中取出放入装有蒸馏水的瓷盘中, 用蒸馏水漂洗 2 次。 (2) 银染: 加入染色液(0.2%的 AgNO3、 1%的冰醋酸、 10%的无水乙醇)进行银染, 然后用蒸馏水漂洗 2 次。20min (3) 显影: 加入显影液(3%的无水 NaOH, 每 200 mL 溶液加 1 mL 甲醛)进行显 色。8min (4) 凝胶摄影: 用数码相机对凝胶进行照相。

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