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聚丙烯酰胺凝胶电泳常见问题分析与预防措施

发布时间 2021-01-31 06:38

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  ! ! 种子科技 ! !#!!! !适 用 技 术! 聚丙烯酰胺凝胶电泳常见 问题分析与预防措施 邱金枚 赵玉平 ! 乌兰察布盟种子管理站 #内蒙古 集宁 中图分类号 # $ %%&’%( 文献标识码 ) * !#!!! 文章编号 ) !!+,#-&! $#!!% %!#,!!.,!# 聚丙烯酰胺凝胶电泳法除用于鉴定种子纯度外 还可以广泛用于遗传育种 &基因定位 & 种子活力测定等 方面 但在使用过程中经常会遇到一些故障和问题 影 响实验的正常进行 甚至会严重影响鉴定结果 ’笔者经 过多年实践 对其总结 & 分析和研究 现以杂交玉米种 子纯度鉴定为例归纳如下 # ! 谱带不清晰或特征谱带不明显 ’ 凝胶贮备液 $样品提取液失败 配制好的贮备液 & 提取液在 / ! 条件下贮存 #! 0 效果较好 时间太长有些药品会失效 ( ’# 样品提取时间太短 要求加样品提取液后摇匀 + 123 后再摇一次 %! 123 后用离心机 )+!!! 4 123%离心 + 123 取上清液电 泳( ’% 磨样时样本颗粒掺混 样本掺混时 两个样本的特征同时被表现 谱带难 以辨认 ( 要注意磨完每粒样品后擦净磨样器 使用的承 样纸也要每次换一张 ( ’/ 点样时发生漂移 在点样时 由于人为串位或样品梳间凝胶被破坏 样液自然漂移造成特征谱带重合 ( 注意插取梳子的时 间要恰当 用力要均匀 点样时要专心认真 ( ’+ 电压太低 不同品种要求不同的适当电压 ( 电压太低时谱带 走不开 即迁移率 )56 % 差别不太大 特征区不明显 ( ’- 电泳超时 电泳时间过长 能够表现品种特征的蛋白质谱带 泳到下部或缓冲液中 则不能观察谱带特征 (要注意观 察 当甲基绿指示线下到离玻板底部 71 即可停止电 泳( ’. 染色液陈旧 #染色时间太短 由于多次染色 胶面带水 使染色液浓度降低或考 马斯亮兰沉积而影响染色效果 ( 要经常更换染色液或 再添加少许染料乙醇溶液 ( 一般染色时间为 %! !条件 下 # 8/ 9( ’: 某些药品实际成分不足 如三氯乙酸吸水 染色液有效成分降低 染色效果 欠佳 (注意三氯乙酸和考马斯亮兰的有效成分 必要时 需更新 ( ’& 电泳时室温太高 室温太高 使某些药品成分发生变化 致使谱带不 清晰 ( 因此 在冰箱进行电泳效果最好 ( ’! 用加酶洗衣粉冲洗胶面 洗衣粉中的酶具有增白作用 会冲去胶板的蓝色 而影响谱带的清晰度 ( 要使用不加酶的洗衣粉 ( 谱带不整齐 #’ 玻璃板不干净 玻璃板有污点 凝胶与玻璃粘合不紧密 电泳时蛋 白质迁移速度不一致 ( 因此 制板前要将玻璃洗净 & 晒 干( #’# 药液比例不适当或未摇匀 由于称量 &定容 &取液不准确或操作误差改变了凝 胶浓度 影响了成胶速度及胶的硬度 导致凝胶孔径改 变 最终影响蛋白质在凝胶中的电泳速度 ( 因此 要准 确称量 规范操作 ( #’% 分离胶 $ 浓缩胶中有气泡 胶板中有气泡 当蛋白质电泳到气泡时会停止或 偏向下移 导致谱带不整齐 ( 在灌液时 要使电泳槽稍 微倾斜 避免产生气泡 发现气泡立即用钢丝挑出 ( #’/ 分离胶不整齐 分离胶不整齐会直接影响蛋白质相对迁移距离 造成谱带高低不平 ( 在灌入分离胶后用手振荡一下电 泳槽 振平胶面 迅速用正丁醇封住胶面 ( 水封时注意 不要冲坏胶面 ( 用滤纸吸水时 不能接触胶面 ( # 谱带颜色深浅不一致 %’ 种子成熟度不一致 成熟度越好 盐溶蛋白质含量越高 谱带越清晰 否则颜色浅一些 (在分析谱带时要注意这一点 不能因 色浅而误断 ( %’# 点样时用量不一致 因样品提取液与样品量比例不符或点样器原因或 人为操作原因造成样品有效量不一致 ( 这种误差难以 完全消除 只能通过各种途径控制减少误差 ( %’% 磨样时包含重要特征的部位丢失 如玉米种子的胚部丢失 含有特征的盐溶蛋白不 能表现在谱带上 故无色或颜色较浅 ( 在磨样时要注意 ! ! !. ! 种子科技 ! ! !#!! ! *适用技术 浅谈杂交玉米制种花期预测与调节 郑文江 ! 蔺清详 ! 新疆伊犁农四师六十六团种子站 # 霍城 中图分类号 # + &!%,%) 文献标识码 # - )%&$!* 文章编号 #!,,&.$/*,&$,,%’,$.,!,).,$ 杂交玉米制种产量高低的关键在花期是否相遇 ! 而花期相遇的关键在于及早预测和调节 因此 ! 及早做 好制种玉米的花期预测及调节十分重要 ! 花期预测 杂交玉米花期预测的方法很多 ! 笔者经实践观测 ! 认为最准确的有以下两种 # !! 叶片检查法 在玉米拔节后检查母本和父本的叶片数 ! 如果两 个亲本的总叶片数相同 ! 而母本已出叶片数比父本多 ! #$ 片时 !花期才能良好相遇 如双亲的总叶片数不 同 !或者双亲的总叶片数不确定 !则应根据父本和母本 已出叶片数 $出叶速度和未出叶片数而定 如母本未出 叶片数保持比父本少 ! #$ 片叶时 ! 则花期相遇良好 % 如超过 $ 片或少于 ! 片 ! 则有可能相遇不好 !$ 幼穗检查法 拔节孕穗期 ! 在制种田选择 % #& 个有代表性的 样点 ! 每样点取有代表性的父 $ 母本植株 % #& 棵 ! 剥 去叶片 ! 检查幼穗大小 如果母本的幼穗分化早于父本 ! 个幼穗分化期 & 如母本处于小穗期 $ 父本处于小穗原 基期 ’时 !则预示花期相遇良好 ! 否则可能不遇 父母本花期调节 花期调节是一项复杂的综合技术 ! 是制种成败的 关键 首先 ! 制种技术人员要了解双亲组合的特征特性 和当地气候特点及栽培技术水平 ! 然后才能确定如何 调节或采用什么方式调节 笔者通过多年的实践总结 ! 认为以下两种为行之有效的方法 # 一是播期调节 ! 它包 括同期播种和错期播种 %二是生育期间的调节 ! 包括苗 期 $拔节期和扬花期间的父 $ 母本花期的调节 $! 播期调节 $!! 同期播种 # 制种玉米双亲花期相同或父本比母 本叶片数多 ! 片的情况下 !一般采用同期播种 ! 花期相 遇较好 $!$ 错期播种 # 错期播种是指制种玉米双亲花期相 差 & ’ 以上 ! 或者虽然花期相差 $ ’ 左右 ! 但母本雌 $ 雄不协调 ! 吐丝推迟较多的情况下 ! 采用错期播种 在 管理上 ! 先种花期较晚的亲本 !隔父母本花期相差天数 的 !& #$ 倍时间再播另一亲本 由于玉米花粉生活力 仅几个小时 ! 散粉期短 ! 而果穗花丝生活力则可维持 ( ’ 左右时间 ! 在安排错期播种时要掌握 ( 宁要母等父 ! 不要父等母 )的原则 另外 ! 对从外地新引进的杂交组 合 !要摸清其生育期 !确定在当地的错期天数 若时间 不允许 ! 可依据引种规律和经验确定一个范围 ! 然后将 父本种子分为三份分三期播种 ! 从而延长父本的散粉 期 !确保制种成功 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 将样品完全收集 ! 特别是在种子水分较高时种子胚部 容易粘在磨上 !可在 0, !下烘干 ! #$ 1 %0 染色时胶板重叠 染色时因染色液少或胶板多会造成胶板部分重 叠 !重叠部分着色浅 染色时染色液量要大一些 ! 或使 用多个染色槽 0 谱带拖尾 0! 电极缓冲液失效 电极缓冲液存放时间过长或使用次数太多 ! 引起 蛋白质谱带扩散 电极缓冲液最好是现用现配 ! 使用最 多不超过 0 次 0$ 分离胶面不平 分离胶面不平 ! 出现倾斜度 !则会造成蛋白质谱带 出现拖尾现象 灌胶后要迅速振荡 !放置水平 0% 电压太高 当电压太高时 ! 电泳速度加快 ! 蛋白质分离效果 差 !并出现拖尾现象 一定要根据品种选择适当的电压 * * !,) 稳压电泳 !不可急于求成 # 电泳不跑 电泳不跑主要是电路没有接通 !有以下原因 #! 电 极接反 %电极缓冲液不够 %# 电泳仪接线盒插头没插 好 %$ 电泳仪保险丝断裂 %%电泳槽铂丝断裂 要逐项 检查电路 !排除故障 $ 其它故障 /! 胶板容易龟裂 一是因为玻璃板陈旧发生粘板 ! 要及时更换玻璃 板 二是药品比例不当 ! 凝胶太硬或太软 ! 缺乏韧性 在操作时 !要严格按照比例定量操作 /$ 胶面不齐 在振荡无效时 ! 则 是 因 为 催 化 剂 &23’ 量 太 大 ! 凝 结速度太快 要减少 23 用量 ! 使凝胶时间控制在 !& 456 左右 收稿日期 $$,,$.!!.!&北京快3

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