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实验三聚丙烯酰胺凝胶电泳分析ppt

发布时间 2021-03-11 02:42

  (2)加液:向下电泳槽加入适量的硼酸-硼砂缓冲溶液,没过凝胶管的底部和电极,注意胶柱下方不要有气泡。 (3)加样:用胶头滴管吸取配好的样品液,沿管壁缓慢加在凝胶柱上边,加样量以凝胶管内样品液高度2~3mm为宜。加样枪不可插入过深,以免刺破凝胶,同时要缓慢、均匀,以免搅动缓冲液引起样品扩散。 (4)封液:用胶头滴管吸取电极缓冲液,沿管壁慢慢加入凝胶管上方至加满凝胶管,注意不要使缓冲液与样品液混在一起。 (5)然后向上电泳槽中加入电极缓冲液,使凝胶管的上端被缓冲液浸没,随后盖上电泳槽的槽盖。 (6)电泳:将上层电泳槽的电极接电泳仪的负极,下槽接电泳仪的正极,接通电源。调节电流为lmA/管,5min后,样品液被压缩成一薄层,调节电流为3mA/管。待示踪染料运动至凝胶管下端管口时(离管下口0.5cm),切断电源,结束电泳(时间约为30~50min)。 4.剥胶:将上下电泳槽的缓冲液回收到试剂瓶中,取下凝胶管,以注射器吸取蒸馏水,用10cm长针头沿凝胶管壁插入胶柱与管壁之间,针头切面朝向凝胶管壁,从负极端紧贴管壁,边注水边进针,使胶柱与玻璃管松动,最终使凝胶柱从玻管中缓慢滑出。必要时用洗耳球在一端轻轻加压。(注入蒸馏水做润滑剂,针头螺旋式前进,缓缓剥离) 5.固定:12.5%三氯醋酸溶液,10min。 6.染色:考马斯亮蓝染液,60℃,10min。 7.脱色:脱色液,60℃,10min,直至底色基本褪去,可清晰的观察到10~20条蛋白质区带。 五、结果与分析: 经染色脱色后的胶柱,在日光下观察,至少可看到10~20条蛋白质着色区。从正极到负极依次为:白蛋白区、α1-球蛋白区、α2-球蛋白区、β-球蛋白区和γ-球蛋白区。 区带观察:1.排列顺序 2.区带宽窄 3.颜色深浅 前清蛋白 白蛋白 ?2-球蛋白 ?1-球蛋白 ?-球蛋白 ?-球蛋白 5~8条 3.5cm 18.5% 3~5条 1.5cm 8.8% 6~12条 2.5cm 7.4% 5~7条 1.0cm 3.11% 2~3条 0.5-0.8cm 62.6% 六、注意事项 1.丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺都是神经性毒剂,对皮肤有刺激作用、但在形成凝胶后则无毒,因此在形成凝胶之前应尽量注意避免直接接触。丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中,用前检测pH值是否失效。失效液不能聚合。 2.配胶的时候要按照表的顺序加入,配好胶后应尽快灌胶,不要形成气泡,汽泡会影响电泳分离效果。 3.刚灌注分离胶混合溶液后,应立即在分离胶液面上加3~5mm高的水层,以阻隔空气。胶液面上加水及吸水,还有加样层时要特别小心,缓慢加入,以免冲坏凝胶的胶面。灌胶和电泳时要注意排气泡. 4.装槽装稳、直、平。电泳时凝胶管不能漏水,并且与电泳池垂直。切记装柱后应用蒸馏水密封. 5. 加速剂(TEMED)要密封保存,过硫酸溶液现配现用,防止氧化失效。 6.蛋白加样量要合适。加样量太少,条带不清晰;加样量太多则泳道超载,条带过宽而重叠,甚至覆盖至相邻泳道。加样时不能损伤凝胶表面. 7.剥胶宜小心,否则前功尽弃。 8. 电泳时凝胶管不能漏水,并且与电泳池垂直 9.固体切忌倒入水池。 * 这种分子筛效应与我们讲的层析中的分子筛效应是不同的,层析中会凝胶过滤层析法又称分子筛层析,主要是根据蛋白质的大小和形状进行分离和纯化。层析柱中的填料是惰性的多孔网状结构物质,小分子物质能进入这些网状结构内,流下来速度慢,而大分子物质却被排除在外部,只能在这些网状结构间运动,流下来的速度快, 配制溶液的时候要注意液体的准确量取,加速剂要最后加 * ,须缓慢细心,尽量减少胶液表面的震动,防止胶液面被破坏或水层与胶液的混合。水封的原因呢,一是防止分离胶溶液的氧化,二是为了胶面的平整,利于电泳在一条直线上。 * (凝胶元气泡、裂缝、剥离或无聚合不匀)上端能看到胶面,一定要插紧, * ,注意,针头的斜面对着凝胶管。 * 染料应浸没全部凝胶, * 实验三 血清蛋白质 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳 PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) 一、实验目的 1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离血清蛋白质的方法。 蛋白质的分离 蛋白质是生物大分子化合物,具有胶体性质、沉淀、变性和凝固等特点蛋白质分离纯化的方法主要有:盐析、透析、超离心、电泳、离子交换层析、分子筛层析等方法。 电泳技术 电泳蛋白质在一定的pH溶液中可带有电荷,成为带电颗粒,在电场中向相反的电极方向泳动。由于蛋白质的分子量和电荷量不同,其在电场中的泳动速率也不同,从而将蛋白质分离成泳动速率快慢不等的条带。 电荷的来源 蛋白质带有可解离的氨基(-NH2)和羧基(-COOH),是典型的两性电解质,在一定PH条件下会解离带上电荷 COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 迁移率 电场力 F=EQ (E:电场强度, Q:电荷) 阻力 F=6πγηυ (γ:半径,η:介质粘度) υ/E表示单位电场强度时粒子运动的速度,称为迁移率 ,也称位泳动度,以μ表示: μ= υ/E=Q/πγη 可见,离子的迁移率在一定条件下取决于粒子本身的性质, 即其所带的电荷和形状。不同的粒子有不同的迁移率,因此 电泳一定时间就可分开它们。 样品性质 与分离样品所带电荷成正比,与样品相对分子质量成反比。 电场强度 电压越高,带点粒子移动越快。 缓冲液的性质 缓冲液的PH值距等电点越远指点所带静电荷越多,迁移速度越快;反之越慢。离子强度等于1/2∑cizi2 支持介质 理想电泳支持介质应是网状结构、不带电荷、对被分离物质无吸附作用的惰性材料。 温度 影响电泳分离效果的因素 电泳的分类 1、根据固体支持物种类的不同 纸质电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2、根据电泳装置不同 薄膜电泳 垂直板电泳 平板电泳 垂直圆盘电泳 二、实验原理 1.电泳的分类 按分离目的:分析电泳和制备电泳 按电场强度:常压电泳和高压电泳 按电泳媒介:自由电泳和区带电泳 区带电泳(按支持介质):淀粉凝胶电泳 滤纸电泳 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 按支持介质形式:水平式电泳、垂直电泳 按缓冲液pH值:连续pH和不连续pH电泳 2.概念 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)是一种人工合成的凝胶,由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂(过硫酸铵或核黄素)的作用下,聚合成含有酰胺基侧链的脂肪族长链,相邻的两个链通过甲叉桥交联,形成具有三维网状结构的聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶电泳:以此凝胶作为支持物的电泳技术,称为聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称PAGE。 聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12~25个组分。因此适用于不同相对分子质量物质的分离,且分离效果好。 根据有无浓缩效应可分为:连续系统与不连续系统,其中不连续系统因具有浓缩效应,分离条带清晰度及分辨率较佳应用更为广泛,本次试验应用的为不连续系统。 不连续系统 成分 pH值 孔径 电泳缓冲液 甘氨酸(慢离子) 6.0 样品 蛋白质 浓缩胶 Cl-(快离子) 6.7 大 分离胶 Cl-(快离子) 8.9 小 有效迁移率 = 迁移率 × 解离度 氯离子蛋白质阴离子甘氨酸阴离子 聚丙烯酰胺凝胶电泳的优点: 凝胶透明,弹性、机械强度好; 化学稳定性高,几乎无吸附和电渗作用; 具有三维网状结构,起到分子筛作用。可以通过控制单体浓度或者单体与交联剂的比例聚合制成不同大小孔径的凝胶,使分子筛效应与电荷效应结合起来,具有极高的分辨率; 样品不易扩散,能自动浓缩成很薄的样品层; 所用的样品量小,分离效果好。 表面积大而薄,便于通冷却水以降低热效应,条带更清晰。 可多个样品的电泳 胶板制作方便,易剥离,样品用量少,分辨率高。 胶版薄而透明,可制成干板,便于长期保存与扫描。 可进行双向电泳。血清蛋白在醋酸纤维素薄膜电泳中,只可以分离出5~6条区带,而在聚丙烯酰胺凝胶电泳中可分离出数十条区带。 3.基本原理 本实验利用聚丙烯酰胺凝胶作电泳支持物。电荷数和分子大小不一的各种血清蛋白质通过浓缩效应、电荷效应、分子筛效应而被精细地分离。由于具有以上三种效应,所以此方法分离效果好,分辨率高,血清蛋白在纸上电泳仅能分成5~7个组分,而在聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳中可分出10~30个组分。 1.样品胶:PH为6.7 2.浓缩胶:是大孔胶,PH为6.7的TRIS-HC1(省略) 3.分离胶;是小孔胶,PH为8.9 4.电极缓冲液:是PH为9.0的硼酸-硼砂缓冲液 图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面) 分离机制 (1)浓缩效应——低电流压缩效应 无论哪种电泳,样品加入后颗粒分散,不能从同一起点开始电泳,要想得到良好的分离效果,电泳开始前必须使样品中各种成分同处于同一起跑线上,使颗粒同时开始电泳。 因此采用低电流压缩,使样品在达到小孔径的分离胶时,已被浓缩成几个微米的很薄的一层。 分 离 胶 分 离 胶 (2)电荷效应:在均一电势梯度和pH的分离胶中,由于各种蛋白质分子的等电点不同,在同一pH的分离胶中所带有效电荷不同,因而迁移率也就不同。根据电泳的基本原理,带电荷越多,运动速率就越快,经过一段时间的电泳分离,各种蛋白质就按泳动速率快慢顺序排列成一个一个圆盘状的蛋白质区带。 电泳速度的大小: V = QE 6π?R ∝ Q R F= F′ 电场力 F=QE 摩擦力 F′= 6π?RV QE= 6π?RV 运动速度 (3)分子筛效应:由于分离胶的孔径较小,各种蛋白质分子由于分子大小和构象不同,因而通过一定孔径的分离胶时所受的摩擦力不同,受阻滞的程度不同。分子小,受阻滞小的走在前面;而分子大,受阻滞大的走在后边,这样就使大小、形状不同的蛋白质样品得以分离。即使蛋白质所带的净电荷相似,也会由于分子筛效应被分开。 凝胶过滤层析中的分子筛效应 大分子移动快,小分子移动慢 三、主要试剂与仪器: 仪器:电泳仪,圆盘电泳槽 电泳玻璃管(8×0.5 cm) 试剂:分离胶缓冲液,单体交联剂 电极缓冲液,样品稀释液 固定液,染色液,脱色液 新鲜羊血清,保存液 试剂编号 试剂名称 配置 1 4*分离胶缓冲液 1mol/L盐酸24.0mL/100mL, Tris 18.2g/100mL (pH 8.9) 2 30%单体交联剂 丙烯酰胺30.0g与甲叉双丙烯酰胺0.8g 100mL 3 催化剂 10%过硫酸铵 (临用前配置) 4 加速剂 TEMED 1mL加蒸馏水到10mL 5 4*浓缩胶缓冲剂 mol/L 盐酸48mL/100mL, Tris 5.98g/100mL (pH6.7) 6 10*电极缓冲剂 甘氨酸28.8g与Tris 6.0g 加蒸馏水至100mL 稀释(pH 8.3)临用前十倍稀释 7 2*上样缓冲剂 溴酚蓝0.05g 20mL甘油,加5号试剂25mL,定溶至100mL 8 固定液 三氯乙酸12.50g 加蒸馏水至100mL 9 考马斯亮蓝R250染色液 1.25g考马斯亮蓝R250,溶于227mL甲醇中加蒸馏水227mL冰醋酸46mL 10 脱色液 甲醇:冰醋酸:水按3:1:6比例配合 实验操作 凝胶柱的准备 (凝胶溶液配制表见教材表4-4) 取玻璃管,一段封口 加入分离胶溶液(7cm) 加入蒸馏水 制备分离胶应迅速 为了使表面平整,与空气隔绝 静置待凝胶聚合 浓缩胶制备(1cm) 吸取上表面蒸馏水 待凝胶与水面的界面重新可辨 切勿触动胶面 参见分离胶 加入分离胶溶液(7cm) 制备分离胶应迅速 加入分离胶溶液(7cm) 制备分离胶应迅速 加入分离胶溶液(7cm) 制备分离胶应迅速 加入分离胶溶液(7cm) 制备分离胶应迅速 加入蒸馏水 为了使表面平整,与空气隔绝 取玻璃管,一段封口 加入分离胶溶液(7cm) 制备分离胶应迅速 取玻璃管,一段封口 加入分离胶溶液(7cm) 制备分离胶应迅速 取玻璃管,一段封口 加入蒸馏水 为了使表面平整,与空气隔绝 加入分离胶溶液(7cm) 制备分离胶应迅速 取玻璃管,一段封口 四、操作步骤: 1.凝胶柱的配制: 配胶-立柱-灌胶-水封-静置-去水层 (1)配胶——配制分离胶溶液。 分离胶缓冲液 2.0mL 单体交联剂 4.34 mL 蒸馏水 13.48 mL 催化剂 0.2 mL 加速剂 0.05 mL 最后加 总体积20.07 mL,丙烯酰胺浓度6.5%。 (2)立柱:取8×0.5 cm的玻璃管,一端用封口膜封好,垂直插入橡皮垫子中,并将之稳定于架子上。 (3)灌胶:用胶头滴管吸取配置好的分离胶溶液,插入玻璃管底部,沿管壁缓缓注入胶液至离上端约1cm处。如有气泡,可轻轻叩打玻管,排除气泡。管的下方不要漏胶。 注意:灌胶完毕后立即清洗胶头滴管和小烧杯。 (4)水封:立即用胶头滴管沿凝胶管内壁在已加的胶液上边加入约3~5mm高的蒸馏水。须缓慢进行,防止胶液面被破坏或水层与胶层的混合。 (5)静置:40min,使其充分聚胶。胶柱上端有一明显折光界面,表示凝胶已完成。 (6)去水层:聚胶后,用注射器小心吸去胶液上的水层,并用滤纸将残存的水分吸干。注意不要破坏胶面的完整性。 2.样品液的制备:取血清 0.05ml,加入样品稀释液0.95 mL,内含溴酚蓝作为示踪染料,混匀备用。 3.电泳 装柱-加液-加样-封液-电泳 (1)装柱:选择合适的凝胶管,去掉下端的封口膜,垂直插入上层电泳槽的橡胶塞孔中,留有适当的高度(要使凝胶表面露出橡皮塞),若有没插满的孔要用实心的橡皮塞堵塞。每个孔都要塞紧,防止漏液。 装 柱 将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中,加入电极缓冲液与下电泳槽,随后放入凝胶管及上槽,除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜,下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜) * 这种分子筛效应与我们讲的层析中的分子筛效应是不同的,层析中会凝胶过滤层析法又称分子筛层析,主要是根据蛋白质的大小和形状进行分离和纯化。层析柱中的填料是惰性的多孔网状结构物质,小分子物质能进入这些网状结构内,流下来速度慢,而大分子物质却被排除在外部,只能在这些网状结构间运动,流下来的速度快, 配制溶液的时候要注意液体的准确量取,加速剂要最后加 * ,须缓慢细心,尽量减少胶液表面的震动,防止胶液面被破坏或水层与胶液的混合。水封的原因呢,一是防止分离胶溶液的氧化,二是为了胶面的平整,利于电泳在一条直线上。 * (凝胶元气泡、裂缝、剥离或无聚合不匀)上端能看到胶面,一定要插紧, * ,注意,针头的斜面对着凝胶管。 * 染料应浸没全部凝胶, *

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