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聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质汇总

发布时间 2020-07-23 10:01

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  聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质 Po1yacrylamide gel electrophoresis 实验原理 采用不连续系统(即缓冲液成分、pH 及凝胶孔径不连续)聚丙烯酰胺凝胶电泳, 通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应,将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多 少不同而进行高效分离。 (参看理论部分) 仪器设备 1.电泳玻管 内径 0.5 cm,长 12 cm 2.小胶管、玻棒 直径 0.7—0.8cm,长 1.5—2 cm 3.玻璃滴管、吸管、毛细滴管(灌胶用) 4.微量加样器(50u1)(上样用) 5.桑玻氏管或灯泡瓶 6.线.电泳槽、青霉素瓶塞(有孔)、竹筒 9.电泳仪(50mA、400V 以上) 10.注射器(5m1)和长针头(剥胶用) 11.培养皿 试剂 1 1.丙烯酰胺(Acr)和甲叉双丙烯酰胺(Bis):一般可用分析纯(或标准纯)的 Acr 利 Bis, 无需进一步提纯。但工业用的 Acr 利 Bis 必需提纯或重结晶后才能应用。 Acr 的重结晶:将 Acr 溶于 50℃氯仿中(70 克/升),趁热过滤,冷却至-20℃结晶, 冷却的布氏漏斗过滤收集结晶,用冷氯仿淋洗,将结晶真空干燥。 纯化的 Acr 水溶液的 pH 值在 4.9~5.2,只要 pH 变化不大于 0.4pH 单位,就可使用。 必要时可反复重结晶。 Bis 重结晶:12 克 Bis 溶于 40~50℃丙酮 1 升中,趁热过滤。凉后置-20℃结晶,过 滤或离心收集结晶。用冷丙酮洗涤,真空干燥。 Acr 和 Bis 的贮存:固体 Acr 和 Bis 应贮存棕色瓶中,在干燥、低温和暗处保存,并 注意避免超声波、γ -辐射和自然光的照射,(因可引起 Acr 自身聚合而失效)。Acr 和 Bis 贮存液,由于水解生成丙烯酸和 NH3 而失效,贮存于 4℃冰箱可延缓水解,但也只能保 存 1—2 月。 Acr 利 Bis 是神经性毒剂,同时对皮肤有刺激作用。操作时应予以注意防护,大量 操作(如纯化)时应在通风柜中进行,并避免吸入尘埃。 2.TEMED-四甲基乙二胺,避免冰箱保存。 3.过硫酸铵(不能潮解,否则不能用) 4.染色液:用 0.05N NaOH 配制 0.1%溴酚兰液 5.洗脱液:7%醋酸 6.其他试剂:见下表贮存液的配制 按表 1 配制各贮存液置冰箱中贮存,可放 1—2 月(但过硫酸铵液贮存冰箱不能超 过一周) 。 表1 贮存液及工作溶液的配制 2 贮存液 100ml 溶液中的含量 1N HCl 48.Oml 36.6 克 0.23ml 28.0 克 0.725 克 0.14 克 48.Oml 5.98 克 0.46ml 10.0 克 2.5 克 40.0 克 pH 工作溶液配制的体积比 分离胶制备: 1 份 1 号,2 份 2 号,1 份 1 Tris TEMED 2 3 Acr Bis 8.9 水; 抽气后加入 4 份 3 号 凝胶浓度 pH 7% 8.9 过硫酸铵 1N HCl 4 Tris TEMED Acr Bis 蔗糖 浓缩胶制备: 1 份 4 号,2 份 5 号 6.7 抽气后加入 4 份 6 号 凝胶浓度 pH 2.5% 6.7 5 6 电泳槽缓冲液: 7 Tris 甘氨酸 实验操作 0.60 克 2.88 克 8.3 用时可稀释 10 倍 500ml 可供 12 根电泳管 1.每人取电泳管 1 支,标好号码,玻棒堵住底部,加 1—2 滴 40%蔗糖于底端。(与 橡皮接触部分凝胶不易聚合)。 2.分离胶制备:10 人一组。 吸取:1 号 2号 水 2ml 4ml 2ml 在桑玻氏管中混匀,用真空泵抽气至无气泡为止。 抽气后加 3 号 8ml,混匀备用(可灌胶 12 支) 。 3 3.用玻璃滴管灌胶于电泳管中,高约 8cm,然后在距胶面约 1cm 处,沿玻管壁缓 缓加入 3-5mm 高的水层(注意:不要打乱凝胶液面,切忌加入的水呈滴状坠入!),垂直 静置凝胶让它进行聚合反应。聚合时可见原来加入水层出现的界面逐渐消失 (因相互扩 散),继又出现界面时,表明凝胶已经聚合,再静置 15 分钟使之聚合完全(应在 30—60 分钟内聚成)。 4.样品液制备: 血清 40%蔗糖 1-2 滴 1滴 于一小试管中混匀备用 0.05%溴酚兰 1 滴 5.待分离胶成胶后(重新出现界面 15 分钟)用滤纸条吸干上层覆盖水 6.浓缩胶制备,10 人一组。 吸取:4 号 5号 6号 1ml 2ml 4ml 在桑玻氏管中混匀,真空泵抽至无气泡为止。 抽气后加 3 号 1ml,混匀备用。 7 .用玻璃滴管灌浓缩胶于分离胶上,高约 1 ~ 1.5cm,然后小心覆盖蒸馏水高约 0.5cm,垂置放置,待其成胶。 8.待浓缩胶成胶后,用滤纸条吸干上层覆盖水,拔去底端玻棒塞,用滤纸条吸干 蔗糖液,将胶管套在橡皮塞中,并装至电泳槽内,然后倒入下槽电泳缓冲液,并用缓冲 液灌满胶管底部的空隙,排净空气(否则影响电流通过)。 9.上样:倒入上槽电泳缓冲液,用电泳缓冲液小心灌满玻管上端以排出空气。然 后用微量加样器吸样品液 50ul,加在浓缩胶上。 4 10.电泳:上槽——负极 下槽——正极 盘状电泳仪器装置示意图 注:下电极槽可设计为夹层,需要时可通入冷水以降温 电流:开始三分钟 1.5mA/管 三分钟后 2.5mA/管 一般情况可维持 4 毫安/管,电流太大会产热造成升温,使分离失败,(必要时应进 5 行有效的冷却,如用冷水冷却或在低温室进行电泳)。 电泳过程中一般要求电流保持稳定。电泳与所用缓冲液和样品有关,一般可根据指 示染料的迁移来决定,如指示染料已迁移至凝胶柱的下端附近或已迁至管长达 3/4 距 离时,即可停止电泳。关闭电源。取出玻管。 缓冲液可以再行使用,但上下槽缓冲液不能混合或互换,因下槽中混有催化剂及氯 离子。如换作上槽液,将影响电泳结果。 11.凝胶取出(或剥胶)。 电泳毕,取下电泳玻管,用一长针头注射器(针头长约 6~8 厘米),吸满蒸馏水为润 滑剂,把针头插入玻管内壁和凝胶柱表面之间,缓缓旋转玻管,一边压入水,一边使针 头慢慢呈螺旋式推进,靠水流压力和润滑力将玻管内壁和凝胶分开。最后可用洗耳球在 玻管浓缩胶端轻加压力,就可将凝胶柱压出玻管。一般剥胶是从浓缩胶端开始。剥胶时 的要点是不要损伤凝胶柱表面。 12.固定和染色: 固定:为了防止凝胶内分离成份扩散需进行固定,将剥出的凝胶柱浸泡在 7%乙酸 或 1.5%三氯醋酸的水溶液中数分钟即可,澳门赌场,也可在染色的同时进行固定。 本实验采取 0.1%溴酚兰碱性液直接染色,把胶剥至大试管中,加染色液染色 5 分 钟,染色液回收。用洗脱液(7%醋酸)漂洗脱色,去除凝胶中非特异性吸附的染料,让背 景呈浅色或无色,以使区带清晰,和便于定量分析(光密度计扫描测定)。 13.观看结果,描出血清电泳区带图谱,确定清蛋白有无异常。 注意事项 ① 备好玻管,加蔗糖后,要观察漏不漏,如漏则应换管。 6 ② 灌胶时,管内应无气泡。胶面覆盖水时,要轻、慢,不能冲动界面。 ③ 灌完胶后,玻管要垂置放置。吸干胶面覆盖水时,滤纸不能触动胶面。 ④ 灌胶及电泳过程均要记时间,作好记录。 ⑤ 剥胶时,要边进针,边推水,以免刺破凝胶。 思考题 1.圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高? 2.圆盘电泳的分子筛效应与凝胶过滤的分子筛效应原理上有何不同? 3.在做圆盘电泳时,每次装柱时需在表面加盖一层水,为什么? 7

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