服务热线
当前位置:主页 > 新闻中心 >

澳门赌场实验七_聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血

发布时间 2020-07-23 10:01

  实验七_聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质_生物学_自然科学_专业资料。生物化学与分子生物学实验 实验七 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离血清蛋白质 生物化学与分子生物学实验 实验目的 ? ? ? 掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术

  生物化学与分子生物学实验 实验七 聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离血清蛋白质 生物化学与分子生物学实验 实验目的 ? ? ? 掌握盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 学习盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术 了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用 生物化学与分子生物学实验 实验原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳采用不连续系统(即缓 pH 及凝胶孔径不连续)聚丙烯酰胺 冲液成分、 冲液成分、pH pH及凝胶孔径不连续)聚丙烯酰胺 凝胶电泳,通过 浓缩效应、分子筛效应、电荷效 凝胶电泳,通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效 应,将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷 多少不同而进行高效分离。 生物化学与分子生物学实验 PAG )的聚合反应: ? 聚丙烯酰胺凝胶( 聚丙烯酰胺凝胶(PAG PAG)的聚合反应: (Acr )和甲叉双丙烯酰胺 (Bis ) 由单体聚丙烯酰胺 单体聚丙烯酰胺( Acr) 甲叉双丙烯酰胺( Bis) 交联而成的三维网状结构凝胶。 :交联剂 Bis Bis: (AP) :引发剂,提供自由基, 过硫酸铵 过硫酸铵(AP) 引发聚合反应 (TEMED) :催化剂 , 加快引发 四甲基乙二胺 四甲基乙二胺(TEMED) (TEMED): 催化剂, 释放自由基的速度 生物化学与分子生物学实验 ? 分离机制: 1. 浓缩效应 浓缩胶大孔径,分离胶小孔径 ?凝胶层孔径不连续: 凝胶层孔径不连续:浓缩胶大孔径,分离胶小孔径 电泳缓冲液pH=8.3;浓缩胶pH=6.7; ?pH值不连续: 值不连续:电泳缓冲液 分离胶pH=8.9 电泳液中Gly-(慢离子);凝胶中 ?缓冲液离子不连续: 缓冲液离子不连续:电泳液中 Cl-(快离子);Pr-介于二者之间 ?电位梯度不连续 生物化学与分子生物学实验 成分 电泳缓冲液 样品 浓缩胶 分离胶 甘氨酸(慢离子) 蛋白质 Cl-(快离子) Cl-(快离子) pH值 8.3 6.7 6.7 8.9 孔径 大 小 有效迁移率 = 迁移率 × 解离度 生物化学与分子生物学实验 电泳时,氯离子跑得 最快,留下一段低电导 区,产生高电位梯度(电 位与电导率成反比),使 甘氨酸离子追赶氯离子, 蛋白质夹在中间而被压缩 生物化学与分子生物学实验 分子筛效应 2. 2.分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一 定孔径分离胶时,受阻滞的程度不同而表现出不同 的迁移率 电荷效应 3. 3.电荷效应 电荷量不同,迁移率不同。 生物化学与分子生物学实验 实验仪器及试剂 ? 电泳装置 稳压电源 盘状电泳槽 生物化学与分子生物学实验 ? 毛细滴管 ? 刻度吸量管 ? 灯泡瓶 ? 玻璃管和橡胶帽 ? 微量移液器 ? 注射器和长针头 ? 脱色摇床 生物化学与分子生物学实验 和Bis :棕色瓶保存 ?Acr Acr和 Bis:棕色瓶保存 四甲基乙二胺,避光保存。 ? TEMEDTEMED-四甲基乙二胺,避光保存。 (新鲜配制 ) ? 过硫酸铵 过硫酸铵( 新鲜配制) 0.1 %溴酚兰液 ? 染色液: 染色液:0.1 0.1%溴酚兰液 7%醋酸 ? 洗脱液: 洗脱液:7 ? 其他试剂:见下表贮存液的配制。 生物化学与分子生物学实验 贮存液 1 2 3 4 5 6 7 100ml溶液中的含量 1N HCl 48.Oml;Tris 36.6克 TEMED 0.23ml Acr 28.0克;Bis 0.725克 过硫酸铵 0.14克 1N HCl 48.Oml;Tris 5.98克 TEMED 0.46ml Acr 10.0克;Bis 2.5克 蔗糖 40.0克 pH 工作溶液配制的体积比 分离胶制备: 1份1号,2份2号,1份 水;抽气后加入 4份3号; 凝胶浓度 7%;pH= 8.9 浓缩胶制备: 1份4号,2份5号;抽气 后加入4份6号;凝胶浓度 2.5%;pH = 6.7 用时可稀释10倍 500ml可供12根电泳管 8.9 6.7 电泳槽缓冲液: Tris 0.60克 甘氨酸 2.88克 8.3 生物化学与分子生物学实验 实验步骤 1支,加 1-2 滴40 %蔗糖于橡胶帽内, 1. 每人取电泳管 每人取电泳管1 支,加1-2 1-2滴 40%蔗糖于橡胶帽内, 堵住电泳管底部,塞紧。 12 支) 2. 制备分离胶: (可灌胶 (可灌胶12 12支) 1号2ml 2号4ml 水2ml 在灯泡瓶中混 匀,用真空泵抽 气至无气泡; 最后加 , 加3号8ml 8ml, 混匀备用 生物化学与分子生物学实验 3. 分离胶的灌制 1.5cm 用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口 用毛细滴管灌胶于电泳管中至离管口1.5cm 处,然后在距胶面约 1cm 处,沿玻管壁缓缓加入 3-5 处,然后在距胶面约1cm 1cm处,沿玻管壁缓缓加入 处,沿玻管壁缓缓加入3-5 mm 高的水层, 垂直静置 至再次出现界面时表明凝 mm高的水层, 高的水层,垂直静置 垂直静置至再次出现界面时表明凝 胶已经聚合。 生物化学与分子生物学实验 12 支) 4. 制备浓缩胶:(可灌胶 制备浓缩胶:(可灌胶12 12支) 4 号 1ml 4号 5号 2ml 6号 4ml 在灯泡瓶中混 匀,用真空泵抽 气至无气泡; 最后加 , 加3号1ml 1ml, 混匀备用 5. 吸去分离胶上层的水,灌浓缩胶于分离胶上,高约 1cm ,然后沿管壁小心加入蒸馏水高约 0.5cm 。垂直 1cm,然后沿管壁小心加入蒸馏水高约 ,然后沿管壁小心加入蒸馏水高约0.5cm 0.5cm。 至成胶。 放置 放置至成胶。 生物化学与分子生物学实验 6. 成胶后,吸干上层覆盖水;拔去玻棒塞,吸去下层 蔗糖溶液。将电泳管套在橡皮塞中,装入电泳槽, 然后加入下槽缓冲液,排净管底空气。 制备 7. 样品 样品制备 1-2 滴 血清: 血清:1-2 1-2滴 蔗糖: 1滴 40% 40%蔗糖: 蔗糖:1 溴酚兰: 1滴 0.05% 0.05%溴酚兰: 溴酚兰:1 于一小试管中混匀备用 生物化学与分子生物学实验 8. 上样 倒入上槽缓冲液盖过玻管上端,排出管内的空 30ul , 气,检查有无漏液。用微量加样器吸样品液 气,检查有无漏液。用微量加样器吸样品液30ul 30ul, 加在浓缩胶上。 9. 电泳 —— 负极 ;下槽 —— 正极 上槽 上槽—— ——负极 ;下槽—— ——正极 1.5mA/ 管, 3min 稳流: 稳流:1.5mA/ 1.5mA/管, 管,3min 2.5mA /管,约 1h ,至玻管 3/4 处 2.5mA/ 管,约1h 1h,至玻管 ,至玻管3/4 3/4处 生物化学与分子生物学实验 10. 剥胶 电泳完成后取下玻管,用一长针头注射器吸满 蒸馏水为润滑剂,将针头插入玻管内壁和凝胶柱表 面之间,缓缓旋转玻管,一边注水一边使针头呈螺 旋式推进。最后可用洗耳球在玻管浓缩胶端轻加压 力,就可将凝胶柱压出玻管。 生物化学与分子生物学实验 11. 固定和染色 醋酸固定 3min ; 7%醋酸固定 醋酸固定3min 3min; ? 用7% 溴酚蓝碱性液染色 5min (染色液回收); 0.1%溴酚蓝碱性液染色 溴酚蓝碱性液染色5min 5min(染色液回收); ? 用0.1% (7% 醋酸 )漂洗脱色 用洗脱液(7% (7%醋酸 醋酸) ? 用洗脱液 12. 观察结果,描出血清电泳区带图谱,分析有无异常 生物化学与分子生物学实验 实验结果 — + 生物化学与分子生物学实验 注意事项 ? 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂, 对皮肤有刺激作用,注意避免直接接触。 TEMED 最后加。 ? 制胶时,要充分摇匀,加速剂 制胶时,要充分摇匀,加速剂TEMED TEMED最后加。 . ? 注意观察实验现象:分界面,浓缩效应 注意观察实验现象:分界面,浓缩效应. ﹑脱色 ﹑染液回收。 溴酚蓝染色﹑ 脱色﹑ ? 溴酚蓝染色 ? 固体胶切忌倒入水池。 生物化学与分子生物学实验 思考题 1. 圆盘电泳的分辨率为什么比其他电泳高? 2. 圆盘电泳灌胶时表面要加盖一层水,为什 么?

澳门赌场反水-官网在线

联系人:李经理 座机:0371-642345388 地址:河南省濮阳市巩义市夹津口工业园
微信二维码