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澳门赌场聚丙烯酰胺凝胶方法

发布时间 2020-09-04 07:12

  (1)1 M Tris-HCl PH= 8.0 (Tris 121.1 g,超纯水定容到 1 L,HCl 调节 PH 值, 高压灭菌); (2)0.5 M EDTA PH= 8.0 (Na2EDTA· 2H2O 186.1 g,超纯水定容到 1 L,NaOH 调节 PH 值,高压灭菌) ; (3)50×TAE (Tris 242 g,Na2EDTA· 2H2O 37.2g, 超纯水定容到 1 L) ; (4) 5×TBE (Tris 54 g, 硼酸 27.5 g, EDTA (0.5M, PH 8.0)20 mL,超纯水定容到 1 L) ; (5)40%丙烯酰胺 (丙烯酰胺 190 g,甲 叉双丙烯酰胺 10 g,超纯水定容至 500 mL,棕色瓶保存) ; (6)6% 聚丙烯酰胺 (尿素 420 g, 5×TBE 200 mL, 40%丙烯酰胺 150 mL, 超纯水定容至 1 L) ; (7) 10% APS (APS 2 g,去离子水定容 20 ml,4 ℃保存) ; (8)变性剂 (去离子 甲酰胺 50 mL,溴酚蓝 0.025 g,二甲苯青 FF 0.025 g,EDTA 1 mL,4℃保 聚丙烯酰胺凝胶的制备存) ; (9)染色液 (无水乙醇 60 mL,硝酸银 1 g,醋酸 3 mL,去离子水定容至 600 mL,棕色瓶保存) ; (10)显影液 (NaOH 18 g,去 离子水定容至 600 mL, 用前加 0.5 mL 的甲醛) ; (11) 10 mg/mL 溴化乙锭 EB (溴 乙锭 1 g,超纯水定容至 100 mL,棕色瓶保存) 。 (1) 用洗洁精清洗两块玻璃板(注意,两块玻璃板分开清洗) ,然后分别 平放在水平桌面的垫板上。 (2) 首先用 95%的酒精均匀擦洗两块玻璃板(每块板分别用新手套,防止 亲水板和疏水板之间的污染) ,等待晾干。 (3) 配置亲水基(亲水硅烷 30 μL,醋酸 7.5 μL,无水乙醇 1.5 mL) ,摇匀 之后,迅速且均匀地涂抹在亲水板上;吸取 400 μL-600 μL 的剥离硅烷打在疏水 板上,并迅速且均匀地涂抹在上面。 (4) 两块板自然风干后,在亲水板上放上已洗干净的垫片,之后将疏水板 放在其上面,并用三对夹子固定,夹力相当的夹子对称。 (5) 用量筒称取 60 mL 6%的聚丙烯酰胺溶液倒入锥形瓶中, 并加入 400 μL 的 10% 过硫酸铵、30-80 μL 的 TEMED,轻轻摇匀。 (6) 一手稍微倾斜(10°左右)玻璃板,一手将配置好的聚丙烯酰胺溶液 平缓地倒入两玻璃板之间, 在此过程中要防止气泡的产生。倒好胶之后平放玻璃 板,插上梳子,并在插梳子的两边夹上夹子。 (7) 静止 1 h-2 h,待胶完全凝固后,便可进行电泳。 (4) 两块板自然风干后,在亲水板上放上已洗干净的垫片,之后将疏水板放在 其上面,并用三对夹子固定,夹力相当的夹子对称。 (5) 用量筒称取 60 mL 6%的聚丙烯酰胺溶液倒入锥形瓶中, 并加入 400 μL 的 10% 过硫酸铵、30-80 μL 的 TEMED,轻轻摇匀。 (6) 一手稍微倾斜(10°左右)玻璃板,一手将配置好的聚丙烯酰胺溶液 平缓地倒入两玻璃板之间, 在此过程中要防止气泡的产生。倒好胶之后平放玻璃 板,插上梳子,并在插梳子的两边夹上夹子。 (7) 静止 1 h-2 h,待胶完全凝固后,便可进行电泳。 3.2.4.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (1) 将已经完全凝胶的玻璃板的夹子取下,拔出梳子,在水龙头下清洗玻璃板 的两面,用抹布擦干之后,按装在电泳槽上,并在电泳槽的正极倒入 1×TBE 溶 液,负极加入 0.5×TBE 溶液。 (2) 接通电源,恒定功率 65 W 预电泳 30 min。 (3) 将 PCR 扩增好的产物每管中加入 10 μL 的变性剂,离心,放入 PCR 仪中进行 94 ℃ 5 min 的变性,之后立刻置于冰上。 (4) 用 1 mL 的移液枪吸取 0.5×TBE 的缓冲液吹打加样孔,重复几次,之 后取变性后的混合液 5 μL 迅速上样。电泳时用同样的恒定功率电泳 2 h- 2.5 h。 3.2.4.3 银染 (1) 电泳结束后,关闭电泳仪,用手轻轻的揭开两块玻璃板,将附有凝胶的玻 璃板放入染色液中进行染色 10 min,期间不停的用手水平摇动染色槽。 (2) 将附有凝胶的玻璃板取出,放在去离子水中冲洗 10 s,澳门赌场,立即取出,稍 微沥干。 (3) 在显影液中加入 0.5 mL 的甲醛,并摇匀,把附有凝胶的玻璃板放入 其中,水平摇动,直到条带清晰地出现。 (4) 取出附有凝胶的玻璃板,放入去离子水中冲洗 2-3 次,取出晾干后, 在灯箱上观察并用相机拍照。

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