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澳门赌场凝胶色谱柱的基本介绍

发布时间 2020-09-04 07:12

  目录 1 凝胶色谱 2 分类 3 分子筛效益 4 凝胶种类及性质 5 填料合成技术 6 实验技术 凝胶色谱 高温凝胶色谱仪 凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技 术,由于设备简单、操作方便,不需要有机溶剂,对高分子物质有很高的 分离效果。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱主要用于高聚物的 相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。目前已经被生物化 学、 分子生物学、 生物工程学、 分子免疫学以及医学等有关领域广泛采用, 不但应用于科学实验研究,而且已经大规模地用于工业生产。 分类 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物, 凝胶色谱又可分 为凝胶过滤色谱(GFC)和凝胶渗透色谱(GPC)。 凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子, 凝胶过滤色谱柱如多糖类化合物。 凝胶的代表是葡萄糖系列, 洗脱溶剂主 要是水。 凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物 (聚苯乙烯、聚氯已 烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等) 相对分子质量分布分析及分离,常用 的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶,洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。 凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量 分布,同时根据所用凝胶填料不同,可分离油溶性和水溶性物质,分离相 对分子质量的范围从几百万到 100 以下。 近年来, 凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分 子质量相近的物质,不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。 分子筛效益 一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时, 各分子在柱内同 时进行着两种不同的运动:垂直向下的移动和无定向的扩散运动。大分子 物质由于直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔,而只能分布颗粒之间,所 以在洗脱时向下移动的速度较快。 小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩 散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,即进入凝胶相内,在向下移动的过 程中, 从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地 进入和扩散, 小分子物质的下移速度落后于大分子物质,从而使样品中分 子大的先流出色谱柱,中等分子的后流出,分子最小的最后流出,这种现 象叫分子筛效应。具有多孔的凝胶就是分子筛。 各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围,澳门赌场有最大极限和最小极限。分子直 径比凝胶最大孔隙直径大的,就会全部被排阻在凝胶颗粒之外,这种情况 叫全排阻。两种全排阻的分子即使大小不同,也不能有分离效果。直径比 凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。 如果两种分子都能全部 进入凝胶孔隙,即使它们的大小有差别,也不会有好的分离效果。因此, 一定的分子筛有它一定的使用范围。 凝胶色谱法原理 在凝胶色谱中会有三种情况, 一是分子很小, 能进入分子筛全部的内孔隙; 二是分子很大,完全不能进入凝胶的任何内孔隙;三是分子大小适中,能 进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。大、中、小三类分子彼此间较 易分开, 但每种凝胶分离范围之外的分子,在不改变凝胶种类的情况下是 很难分离的。对于分子大小不同,但同属于凝胶分离范围内各种分子,在 凝胶床中的分布情况是不同的: 分子较大的只能进入孔径较大的那一部分 凝胶孔隙内, 而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内,这样分子较大的在 凝胶床内移动距离较短, 分子较小的移动距离较长。于是分子较大的先通 过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床, 这样就利用分子筛可将分子量不同 的物质分离。另外,凝胶本身具有三维网状结构,大的分子在通过这种网 状结构上的孔隙时阻力较大,小分子通过时阻力较小。分子量大小不同的 多种成份在通过凝胶床时,按照分子量大小排队,凝胶表现分子筛效应。 凝胶种类及性质 (一)聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成凝胶,是以丙烯酰胺为单位, 由甲叉双 丙烯酰胺交联成的, 经干燥粉碎或加工成形制成粒状,控制交联剂的用量 可制成各种型号的凝胶。交联剂越多,孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品 为生物胶-P (Bio-Gel P),由日本 tosoh 的 TSKGEL 的 pw 系列,适合 蛋白和多糖的纯化。 即丙烯酰胺和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺,在催化剂 过硫酸铵作用下聚合形成凝胶。 聚丙烯酰胺(PAM,polyacrylamide) 聚丙烯酰胺简称 PAM,分子量 100~500 万。聚丙烯酰胺主要有两种商品 形式,一种是粉末状的,另一种是胶体,还有聚丙烯酰胺乳液 (上海合成 树脂研究所研制) 。易溶于冷水,速度很慢,高分子量的聚丙烯酰胺当浓 度超过 10%以后.就会形成凝胶状结构。提高温度可以稍微促进溶解, 但温度不得超过 50℃,以防发生分子降解。难溶于有机溶剂。温度超过 120 ℃时分解。中性,无毒。用作增稠剂、絮凝剂、减阻剂,具有凝胶、 沉降、补强等作用。贮存于阴凉、通风、干燥的库房内,防潮、避光、防 热。存放时间不宜过长。 凝胶色谱 (二)交联葡聚糖凝胶(Sephadex) ⑴ Sephadex G 交联葡聚糖的商品名为 Sephndex,不同规格型号的葡聚 糖用英文字母 G 表示,G 后面的阿拉伯数为凝胶得水值的 10 倍。例如, G-25 为每克凝胶膨胀时吸水 2.5 克,同样 G-200 克每克千胶吸水 20 克。 交联葡聚糖凝胶的种类有 G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150, 和 G-200。因此,“G”反映凝胶的交联程度,膨胀程度及分部范围。 ⑵ Sephadex LH-20,是 Sephadex G-25 的羧丙基衍生物,能溶于水及亲 脂溶剂,用于分离不溶于水的物质。 (三)琼脂糖凝胶 琼脂糖 Agarose,缩写为 AG,是琼脂中不带电荷的中性组成成份,也译 为琼胶素或琼胶糖。琼胶糖化学结构由 β -D-吡喃半乳糖 (1-4) 连接 3,6-脱水 α -L-吡喃半乳糖基单位构成。 把琼脂糖,即几乎不含硫酸根的主要成分为多糖的琼脂,溶于热水,冷却 制成的凝胶。制成的小颗粒用于凝胶过滤。适于用 sephadex 不能分级分 离的大分子的凝胶过滤,若使用 5%以下浓度的凝胶,也能够分级分离细 胞颗粒、病毒等。利用其吸附性小的特点,有时用它代替琼脂、以作为免 疫电泳或凝胶内沉降反应的支持物。 琼脂糖凝胶商品名很多,常见的有, 凝胶色谱柱 Sepharose (瑞典, pharmacia ) , Bio-Gel-A (美国, Bio-Rad) 等。 琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构,网状结 构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下,它的结构是稳定的,可以在许 多条件下使用(如水,pH4-9 范围内的盐溶液)。琼脂糖凝胶在 40℃以上 开始融化,也不能高压消毒,可用化学灭菌活处理。 (四)聚苯乙烯凝胶 商品为 Styrogel,具有大网孔结构,可用于分离分子量 1600 到 40,000, 000 的生物大分子,适用于有机多聚物,分子量测定和脂溶性天然物的分 级,凝胶机械强度好,洗脱剂可用甲基亚砜。 填料合成技术 凝胶色谱填料合成技术的进展主要在下面四个方面:填料的微球化、窄粒 度分布多孔硅微球的合成成功、 小孔径多孔硅微球合成成功以及新的硅微 球表面化学改性的发展。 近年来在这方面有较多的新产品,中国也有许多 单位在研制和生产。高效凝胶色谱正在迅速改变凝胶色谱的应用面。 四种多孔硅胶的理论塔板数 高效色谱柱除了对填料的粒度有要求外,对粒度分布也要求相当窄。用一 般的制备方法往往得到粒度较宽的产品,需要进一步过筛。当填料的粒度 在 30 微米以下时,这种过筛非常困难,已经成为填料制备上一个较大的 技术难关。Kirkland,最近利用了尿素和甲醛在酸性介质中形成大小均匀 的液体高聚物, 加入某种硅溶胶时, 硅溶胶的微珠将在液体高聚物中凝聚。 最后把有机高聚物灼烧掉后就能得到由微粒硅珠堆积而成的多孔填料。 这 种堆积硅珠是球形的, 粒度分布很窄,填料的孔径决定于原始硅溶胶的规 格, 用不同的硅胶就可以制得不同孔径的填料。柴志宽等则利用一种硅胶 制成粒度分布窄的填料后,再利用适当的扩孔方法以得到各种孔径的填 料。从这些方法制得的微球填料,粒度分布可以达到相当窄,所以可以不 经筛选直接使用。 用 GPC 和 GPC-LALLS 得到 PS 标样分子量比较 随着进样技术和色谱柱接头设计的改进, 现在已经可以得到柱效每米在八 万到十万的凝胶色谱填料。Wheals 用四种 GPC 用的微球硅胶装填色谱柱, 都能达到每米八万到十万块塔板数的高效。 他用这种色谱柱有效地进行了 案件侦查中所要求的分析问题。 实验技术 (一)层析柱 凝胶渗透色谱仪 层析柱是凝胶层析技术中的主体,一般用玻璃管或有机玻璃管。层析柱的 直径大小不影响分离度,样品用量大,可加大柱的直径,一般制备用凝胶 柱,直径大于 2 厘米,但在加样时应将样品均匀分布于凝胶柱床面上。此 外,直径加大,洗脱液体体积增大,样品稀释度大。分离度取决于柱高, 为分离不同组分, 凝胶柱床必须有适宜的高度,分离度与柱高的平方根相 关,但由于软凝胶柱过高挤压变形阻塞,一般不超过 1 米。分族分离时用 短柱,一般凝胶柱长 20-30 厘米,柱高与直径的比较 5:1─10:1,凝胶 床体积为样品溶液体积的 4-10 倍。分级分离时柱高与直径之线 厘米。层析柱滤板下的 死体积应尽可能的小, 如果支掌滤板下的死体积大,被分离组分之间重新 混合的可能性就大, 其结果是影响洗脱峰形, 出现拖尾出象, 降低分辩力。 在精确分离时,死体积不能超过总床体积的 1/1000。 (二)凝胶的选择 根据所需凝胶体积, 估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体 积约为其吸水量的 2 倍, 例如 Sephadex G-20 的吸水量为 20, 1 克 Sephadex G─200 吸水后形成的凝胶体积约 40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效 果。粒度细胞分离效果好,但阻力大,流速慢。一般实验室分离蛋白质采 用 100-200 号筛目的的 Sephadex G-200 效果好,脱盐用 Sephadex G-25、 G-50,用粗粒,短柱,流速快。 (三)凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。 为了加速 膨胀,可用加热法,即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸,这样可大大 中速膨胀,通常在 1-2 小时内即可完成。特别是在使用软胶时,自然膨胀 需 24 小时至数天,而用加热法在几小时内就可完成。这种方法不但节约 时间,而且还可消毒,除去凝胶中污染的细菌和排除胶内的空气。 (四)样品溶液的处理 样品溶液如有沉淀应过滤或离心除去,如含脂类可高速离心或通过 Sephadex G-15 短柱除去。样品的粘度不可大,含蛋白为超过 4%,粘度 高影响分离效果。 上柱样品液的体积根据凝胶床体积的分离要求确定。分 离蛋白质样品的体积为凝胶床的 1-4%(一般约 0.5-2ml),进行分族分 离时样品液可为凝胶床的 10%,在蛋白质溶液除盐时,样品可达凝胶床 的 20-30%。分级分离样品体积要小,使样品层尽可能窄,洗脱出的峰形 较好。 (五)防止微生物的污染 凝胶色谱分析图 交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质,防止微生物的生长,在凝胶层析中 十分重要,常用的抑菌剂有: ⑴ 叠氨钠(NaN3) 在凝胶层析中只要用 0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长,叠氮钠易 溶于水,在 20℃时约为 40%;它不与蛋白质或碳水化合物相互作用,因 此叠氮钠不影响抗体活力;不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。 叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。 ⑵ 可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2] 在凝胶层析中使用浓度为 0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果最 佳,在强碱性溶液中或温度高于 60℃时易引起分解而失效。 ⑶ 乙基汞代巯基水杨酸钠 在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为 0.05-0. 01%。在微酸性溶液中最 为有效。 重金属离子可使乙基代巯基的物质结合,因而包含疏基的蛋白质 可在不同程度上降低它的抑菌效果。 ⑷ 苯基汞代盐 在凝胶层析中使用浓度为 0.001-0.01%。在微碱性溶液中抑效果最佳, 长时间放置时可与卤素、 硝酸根离子作用而产生沉淀;还原剂可引起此化 合物分解;含巯基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。 研究动向 最近凝胶色谱的大量研究工作仍是多方面的, 其中仪器、 填料、 联用技术、 色谱理论等方面的进展是和整个液体色谱的进展相关的。 但是下面四个研 究动向意义较大,值得注意。 凝胶色谱软件 通过与其他仪器联用, 解决凝胶色谱法测定高聚物分子量分布从相对法向 绝对法过渡。 测定高聚物分子量分布是凝胶色谱最重要的应用。试样先根 据分子体积(即分子量)分离后再检测各组分的分子量及含量。 在凝胶色谱 中试样的分离是在色谱柱中进行的, 被分离后的组分在流出柱子时就同时 连续地用浓度检测器和分子量检测器分别检侧各组分的浓度和分子量, 把 两个检测器的输出讯号用记录仪记录后即得反映分子量分布的凝胶色谱 曲线。 过去由于没有比较灵敏和瞬时响应的分子量检测器,因而利用一组 不同分子量的标样来标定色谱柱, 然后从分子量淋出休积的标定曲线来作 数据换算。 这种用相对方法来检测分子量虽然暂时解决了问题,但是随之 而来的是实验工作量增加以及数据处理方法上存在困难。 实验数据的可靠 性在很大程度上决定于标定曲线、 标样分子量数值以及数据处理方法的可 靠性。 其中色谱柱分离效率不理想所引起的色谱峰加宽效应的改正,不但 实验方法比较烦琐, 而且数据处理也比较复杂, 需要用电子计算机来计算。 所以虽然文献中已经推荐许多据说是比较满意的计算方法, 但这总不是一 个根本解决的方法。 只有真正找到绝对分子量检测器, 问题才算较好解决。 原有的许多分子量测定方法, 由于不能做到足够灵敏的瞬时响应而未能成 功地在凝胶色谱上应用。 最近 Ouano 用激光小角光散射仪(LALLS)来作分子量检测器得到比较好的 结果。实验数据不需要标定曲线,也不必进行峰加宽改正。 示差折光检测凝胶色谱由于激光的准直性较好, 强度较大, 可以允许在较 小的角度下测量较稀溶液的散射光强, 由此可以直接计算出重均分子量的 近似值而不需要象经典光散射那样实验数据还要对浓度和散射角度向零 作双外推。实验上,凝胶色谱仪和激光小角光散射仪联用后,还可与计算 机直接联接进行数据处理。在一次实验进行完毕后,所需要的数据可全部 立即取得。GPC-LALLS 似乎得到更合理的数值。激光小角散射仪已开始商 品化, 预计不久将会有更多的研究工作,来说明已经在何种程度上解决了 凝胶色谱的相对测定过渡到绝对测定。 凝胶色谱中的浓度检测器和通常的液体色谱一样仍然是一个薄弱环节, 继 续在寻找更理想的检测器。 目前最常用的仍然是示差折光检测器和紫外检 测器。 最近 Hoffmann 和 Urban 用自动浊度滴定装置来作浓度检测器也收到一定 效果,特别对二元共聚中测定分子量分布和组成分布,效果比较显著。 Jorgenson 等用光散射法侧定淋出溶质的沉淀,也证明是一个较灵敏的方 法。Francois 等用密度计来检侧浓度,提供了另一条通用性检测器的途 径。 其他如质谱和原子吸收光谱也都能与凝胶色谱联用。 随着应用的扩大, 凝胶色谱可以用于测定高聚物长支链的支化度。 高效凝胶色谱 在整个液体色谱领域里, 高效液体色谱取代经典的液体色谱的趋势是非常 迅速的。 这是由于色谱理论、填料制备技术和仪器合理设计三方面联合发 展的必然结果。 凝胶色谱向高效阶段发展就其本身来说,又是一次意义较 大的进展, 因为凝胶色谱虽然具有许多优点,但是它一直被认为是一种分 离效率比较低、 色谱柱的峰容量小和速度慢的技术。在广泛的非高分子化 合物领域中没有得到应有的使用。 凝胶色谱仪 在经典的凝胶色谱中, 填料的粒度一般用 37-75 μ 。色谱柱长 12 尺以上, 柱径 7.8 毫米,流速通常用 1 毫升/分。在这些条件下,一次实验时间往 往需要三小时。 加快流速会降低分离效率,因为凝胶色谱是一个由扩散控 制的分离过程, 高分子在溶液中扩散较慢, 这就必然使流速受到一定限制。 凝胶色谱峰容量较小的原因是和体积排除的分离机理有关。 这些缺陷的克 服都有待于填料柱效的大幅度提高。 高效凝胶色谱填料的合成成功以及高 效装柱技术的发展,实现了柱效的提高,从而实现了实验时间缩短,峰宽 变窄和峰容量增加。 现在粒度为 10 μ 的填料可以使分子量分布测定时间从三小时缩短到十几 分钟, 这个时间甚至比高分子在溶剂中溶解所需的时间还短。在工业上已 有人用凝胶色谱图来作为订购验收指定分子量分布的高聚物产品。 由于不 需要费太多时间来做条件试验, 凝胶色谱在一般化合物领域里应用时的方 便程度已可以和其他类型高效液体色谱相竞争。

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