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nba直播PCR技术(九):PCR扩增产物的电泳分析

发布时间 2021-02-21 10:10

  琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和 鉴定核酸的方法.琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物.根据琼脂糖的溶解温度, 把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖.低熔点琼脂糖熔点为62~65℃,溶解后在 37℃下维持液体状态约数小时,主要用于DNA片段的回收,质粒与外源性DNA的快速连 接等.

  核酸电泳缓冲液有三种,即Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)和Tris-磷酸(TPE).TBE 与TPE缓冲容量高,DNA分离效果好,但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高,容易使 DNA沉淀.TAE缓冲容量低,但价格较便宜,因而推荐选用TBE.缓冲液中的EDTA可螯合 二价阳离子,从而抑制DNA酶的活性,防止PCR扩增产物降解.

  1.指示剂:核酸电泳常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色,在0.6%、1%、nba直播。1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同.二甲苯青的水溶液呈兰色,它在 1%和1.4%琼脂糖中电泳时,其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA大致相似.

  指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液.载样缓冲液的作用有①增加样 品密度,使其比重增加,以确保DNA均匀沉入加样孔内.②在电泳中形成肉眼可见的指 示带,可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色,使加样操作更方便.

  染色剂:核酸电泳后,需经染色后才能显现出带型,最常用的是溴化乙锭染色法,其 次是银染色.

  溴化乙锭(ethidium bromide,EB)是一种荧光染料,EB分子可嵌入核酸双链的碱基对 之间,在紫外线激发下,发出红色荧光.根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.5ug/ml的EB,有时亦可在电泳后,将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10~15min.琼脂 糖凝胶EB染色,肉眼可见核酸电泳带,其DNA量一般5ng,当溴化乙锭太多,凝胶染 色过深,核酸电泳带看不清时,可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察.

  银染色:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物,然后用还原剂如甲醛 使Ag+还原成银颗粒,可把核酸电泳带染色黑褐色.主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色. 也用于琼脂糖凝胶染色.其灵敏度比EB高200倍.但银染色后,DNA不宜回收.

  (2)根据核酸分子量的大小配制不同浓度的琼脂糖凝胶,一般200~400bp的DNA片段, 可配制1.2~1.7%浓度的琼脂糖用于电泳.

  3.配制0.5XTBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中,称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅 或微波炉内加热熔化.冷却至60℃(需要时可加入溴乙锭),倒入电泳槽中,待凝固.

  4.向电泳槽中倒入0.5XTBE,其量以没过胶面2mm为宜,小心移去梳子.如样品孔内有 气泡,应设法除去.

  6.接通电源,一般红色为正极黑色为负极,切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样 孔的一端为负).电压为1-5V/cm(长度以两个电极之间的距离计算).

  7.根据指示剂泳动的位置,判断是否终止电泳.一般200~400bp的PCR产物50V电压, 电泳20~40min即可.

  (3)溴化乙锭染色后,紫外仪上观察电泳带及其位置,并与核酸分子量标准比较被扩 增产物的大小.

  聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分 析.其装载的样品量大,回收DNA纯度高.长度仅相差0.2%(即500bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离.

  聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂TEMED(N,N,N,N一四甲基乙二胺)和 过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,N,N一亚甲 双丙烯酰胺参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶.

  聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺的浓度决定的,不同浓度丙烯酰胺和DNA的 有效分离范围见表2.

  *表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp).

  1.按要求装配好垂直电泳板,两块玻璃板的两侧及底部用1%的琼脂 糖封边,防止封闭不严而使聚丙烯酰胺液漏出.

  4.加入TEMED后,立即混匀,缓缓倒入两玻璃板间的胶床中,直到液 体接近溢出时为止.

  5.立即插入适当的梳子,密切注意防止梳齿下产生气泡,用一有力 的夹将梳子夹在一边的玻璃板上,然后将玻璃板斜靠在物体上,使 成10°角,可减少液体泄漏的机会.

  6.室温聚合一小时后,将玻璃板插入电泳槽中,上紧,倒入0.1XTBE 缓冲液.

  7.小心取出梳子,立即用缓冲液冲洗加样孔,因为梳子取出后,梳 子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产 生不规则的表面,将导致以后DNA电泳带型不规则.

  8.将DNA样品与适量的载样缓冲液混匀后,加到样品孔内,加样时不 要产生气泡.

  11.电泳毕,切断电源,弃去电泳仪,取出胶床板,小心移去一块玻 璃板,让凝胶吸附在另一块玻璃板上.浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶 液中,15~30min后取出水洗紫外仪下观察结果.

  12.聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带.要求更高 的灵敏度,可用银染.

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