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聚丙烯酰胺凝胶(PAGE胶电泳)电泳的方法与银染方

发布时间 2021-02-21 10:10

  PAGE胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳 )主要是以PAGE为介质,根据DNA分子大小和电荷分离DNA分子。PAGE胶电泳采用银染法进行显色。银染的原理:一、银离子(一般是AgNO3 )和DNA结合;二、还原剂甲醛把Ag+ 还原成银颗粒,最终DNA呈现为黑褐色。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量蛋白质、小于1Kb的DNA片段和DNA序列分析,其装载的样品量大,回收DNA纯度高,nba直播。长度仅相差0.1%(即1000bp中的1bp)的核苷酸 分子即能分离。

  聚丙烯酰胺 凝胶是由丙烯酰胺单体,在催化剂TEMED(N,N,N,N一四甲基乙二胺)和过硫酸铵的作用下,丙烯酰胺聚合形成长链,聚丙烯酰胺链在交联剂,N,N一亚甲双丙烯酰胺(交联剂)参与下,聚丙烯胺链与链之间交叉联接而形成凝胶。聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小是由丙烯酰胺和交联剂的浓度及比例决定的,不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围见下表.

  *表中给出的数字为与指示剂迁移率相等的双链DNA分子所含碱基对数目(bp)。

  (1) KOH/甲醇溶液:5gKOH溶于100ml甲醇中,用于清洗玻璃板。

  4.过硫酸铵0.1g/ml:称取过硫酰铵1g加水至10ml。4℃可保存一周,-20℃可保存一个月。

  5.TEMED(四甲基乙烯基二胺):和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮,4℃封闭保存。

  使用同样的TBE配制胶和电泳液,因为两者间微小的差异就会导致DNA扭曲。

  1.玻璃板处理:KOH/甲醇溶液或KOH溶液浸泡玻璃板一定时间,用去污剂和清水清洗干净,最后用双蒸水冲洗两遍。自然晾干。用95%乙醇擦拭长短板。长短板分别用亲和硅烷和玻璃硅烷均匀擦拭。5-10分钟后再用95%乙醇擦拭长短板。

  2.固定玻璃板:处理面向上,把两个封条分别置于两侧,把梳子置于长板一端的两封条间。短板处理面向下盖到长板上,用夹子固定,再用胶带封闭除放有梳子一端外的其它三边缝,防止漏胶。把固定好的玻璃板长向倾斜适当角度(300),短向倾斜角度(200-300)

  注:由于尿素在室温难溶解,故在配制胶时应提前把尿素溶液置于55℃水浴中预热,是尿素完全溶解。

  4.灌胶:把梳子取出,用注射器取大约50ml的胶溶液,缓缓地使胶溶液注入两板间,等胶溶液快要溢出时,把玻璃板放平,倒插梳子,用夹子夹紧使梳子和玻璃博间没有缝隙从而防止点样时串样,整个过程不要产生气泡。

  5.凝固:灌完胶后,放于室温让其自然凝固,观察胶边沿出现折射线就表明胶以凝固。凝胶可立即使用,或保存于室温24小时,4℃48小时。

  1.固定玻璃板于电泳仪:取掉玻璃板上的夹子,撕掉胶带,用清水冲洗干净玻璃板,短板向里固定于电泳仪支架上,即凹口板面向电泳液。

  2.预电泳:取5xTBE200ml稀释到1000ml制成1xTBE。向电泳仪下端槽内倒1xTBE约500ml,向上槽倒1xTBE,使液面高于短板上沿。拔出梳子,并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净(因为梳子取出后,梳子上吸附的及凝胶顶部未聚合的丙烯酰胺会流入加样孔内聚合,产生不规则的表面,将导致以后DNA电泳带型不规则)。

  1)上样:插入梳子,在预电泳期间把选择性扩增产物94℃变性10min后,迅速置于冰上冷却。向选择性扩增产物中按2:1的比例加上样缓冲液并混匀,取5-6ul上样。

  2)调节电压60W,电泳2小时左右。根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。电泳完毕,关掉电泳仪。取下玻璃板,用冰袋冷却,准备显色。

  聚丙烯酰胺凝胶电泳只能检出10ng以上量的DNA条带.要求更高的灵敏度,可用银染。

  银染的原理:银离子和DNA结合,还原剂甲醛把银离子还原成银颗粒,使DNA条带呈黑褐色而显现出来。其灵敏度比EB高200倍,但银染色后,DNA不宜回收。

  2.洗胶:把经固定的胶板置于盛有1.5L双蒸水的塑料盘中清洗两次,每次2-4min。

  4.洗胶:把经固定的胶板置于盛有1.5L双蒸水的塑料盘中清洗一次,该步骤动作要迅速,约3s。

  把清洗干净的胶板置于盛有显色液的塑料盘中显色。显色时间根据条带和背景颜色深浅调整,达到DNA条带清晰的目的。显色液一定要预冷至4-10,否则会使被背景加深。

  6.终止显色:把染色完毕的胶板放回盛有固定液的塑料盘中,反应3min。用双蒸水清洗两次(每次2min)。

  注意事项:PAGE胶电泳,采用银染法显色后,虽然其灵敏度比EB高很多,但是这种方法不利于DNA回收。

  做这个实验的时,我同一批次提取的蛋白,胶跑出的条带都不一致,这是什么原因呢?

  我做WB也不算是新手,自己觉得整个过程也没有什么明显的问题,可是最后发光的时候内参整个是晕开的,分子还连成了一条线,之前没出现过这种情况,所以想请大家帮忙分析下,是胶的问题,蛋白的问题,还是什么别的,谢啦!

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